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Biotechnologie

Mikrobielle Sekretionssysteme ermöglichen hohe Ausbeuten aktiver Pharmawirkstoffe

| Autor/ Redakteur: Dr. Thomas Maier / Anke Geipel-Kern

Für die biotechnische Herstellung von Pharmaproteinen hat Wacker Chemie einen patentierten E. coli-Stamm zur extrazellularen Produktion entwickelt. Das System schleust Proteine in funktioneller Konformation über die äußere Zellmembran ins Kulturmedium. Diese proprietäre Technologie ermöglicht eine kosteneffiziente Herstellung hochreiner pharmazeutischer Wirkstoffe im industriellen Maßstab.

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Forschungslabor im Biotechnikum der Wacker-Konzernforschung. Durch die Steuerung von Faktoren wie Temperatur und Sauerstoffzufuhr erzielen die Forscher optimale Bedingungen für das Bakterienwachstum.
Forschungslabor im Biotechnikum der Wacker-Konzernforschung. Durch die Steuerung von Faktoren wie Temperatur und Sauerstoffzufuhr erzielen die Forscher optimale Bedingungen für das Bakterienwachstum.
( Bild: Wacker )

Biotechnologisch hergestellte Protein-Pharmazeutika, so genannte Biologics, sind ein enormer Wachstumsmarkt: Krebsmedikamente, Wachstumsfaktoren und Wirkstoffe zur Behandlung multipler Sklerose können in Bakterienzellen erzeugt werden. Laut Jahresbericht 2007 der EuropaBio stellen Biotech-Präparate heute etwa 20 Prozent aller Medikamente auf dem Markt und 50 Prozent der Medikamente in der Pipeline. Marktanalysen zufolge hat sich die Zahl der Biopharmazeutika am Markt in den letzten zehn Jahren mehr als verdoppelt und zeigt in der EU Wachstumsraten von 23 Prozent.

Gerade bei pharmazeutischen Produkten kommen die Vorteile der Biotechnologie zum Einsatz. Anders als bei Proteinwirkstoffen, die aus Blut oder Gewebe extrahiert sind, ist bei modernen Biologics das Kontaminationsrisiko mit Viren gleich Null. Ein weiterer Nutzen liegt darin, dass der pharmakologische Effekt von Proteinen optimiert werden kann, indem man gezielt Aminosäuresequenzen modifiziert.

Mögliche Produzenten für Pharmaproteine sind Bakterien, Hefezellen oder Zellkulturen von Säugetieren. Ein bevorzugter Produzent sind Escherichia coli Bakterien: Diese Bakterien sind gut erforscht, die Handhabung ist sicher und die genetischen Eigenschaften sind bekannt. Wesentliche Vorteile von E. coli sind jedoch vor allem das schnelle Wachstum der Bakterien, ihre bescheidenen Nährstoffansprüche und ihre Fähigkeit, Proteine schnell und in großen Mengen (verglichen mit Säugetierzellen) zu produzieren. Dadurch sind gute Raum-Zeit-Ausbeuten möglich.

Die Schwierigkeit liegt nun darin, die Bakterien zu einem verlässlichen und auch ökonomischen Produzenten größtmöglicher Mengen aktiver Wirkstoffe zu machen. Denn bei Überproduktion rekombinanter Produkte werden diese häufig nicht korrekt gefaltet und innerhalb der Zelle in Form von Aggregaten gelagert (inclusion bodies). Zur Rückgewinnung aktiver Proteine sind dann zahlreiche aufwändige und kostenintensive Rückfaltungs- und Aufreinigungsschritte notwendig.

Extrazelluläre Herstellung

Um die Herstellung von Proteinen und Antikörperfragmenten zu erleichtern, hat Wacker Chemie eine Sekretionstechnologie zur extrazellularen Produktion entwickelt. Dabei kann das gewünschte Proteinprodukt während der Fermentation in korrekter Faltung direkt in das Fermentationsmedium sekretiert werden.

Diese Technik vereinfacht damit den Aufreinigungsprozess enorm: Die Zellen müssen nicht aufgebrochen und die Proteine nicht herausgefiltert und aktiviert werden, denn sie werden bereits in aktiver Form und korrekt gefaltet ins Fermentermedium geschleust. Die Aufreinigung beginnt dadurch mit weniger inhomogenem Material und benötigt wesentlich weniger Schritte, um ein reines Produkt zu erhalten. Außerdem ermöglicht eine extrazelluläre Produktion höhere Ausbeuten der rekombinanten Proteine, weil die Produktanhäufung nicht durch das limitierte Volumen des Zellinneren (Cytoplasma) oder des Periplasmas begrenzt wird. Die Downstream-Kosten reduzieren sich dadurch spürbar.

Die Sekretionstechnologie besteht aus speziellen Expressionsplasmiden und einem im Unternehmen entwickelten und patentierten E.coli K 12 Stamm. Dieser Stamm ist ein E. coli K12 Derivat (biologische Sicherheit Stufe 1), dessen genetische Eigenschaften vollständig bekannt sind. Im Mai 2007 wurde ein entsprechendes Genom-Sequenzierungsprojekt von Wacker Chemie und Eurofins Medienomix/MWG Biotech zur Analyse des Wacker eigenen bakteriellen Protein-Produktionsstamms erfolgreich zum Abschluss gebracht. Die Ergebnisse ermöglichen die genaue Dokumentation der Stammeigenschaften und sind eine Basis zur weiteren Verbesserung des Produktionsstamms.

Zweistufiger Mechanismus

Im Prinzip beinhaltet der Expressionsmechanismus zwei Stufen:

– Zuerst wird das Zielprodukt mithilfe der Sec-Translokase über die cytoplasmatische Membran in den periplasmatischen Raum transportiert. Das unfertige Protein enthält kurze Signalsequenzen, die den Transport aus dem Cytoplasma ermöglichen. Bei diesem Schritt wird das Signalpeptid abgespalten und das native Produkt freigesetzt.

– Im zweiten Schritt wird das korrekt gefaltete Produkt aus dem Periplasma über die äußere Membran direkt ins Kulturmedium sekretiert. Dies ist möglich durch eine ein-zigartige Eigenschaft des proprietären Wacker-Sekretionsstamms: Er besitzt spezifische Modifikationen zur effizienten Sekretion des rekombinanten Proteins.

Die Sekretionstechnologie ist auch in der großtechnischen Fermentation (bis 4,5 Kubikmeter-Massstab) bereits erprobt und hat sich als robust und reproduzierbar erwiesen. Durch einfache Zellabtrennung kann das Zielprodukt dann in einer löslichen, nativen und aktiven Form aus der Fermentationsbrühe isoliert werden.

Inzwischen wurde eine Art Toolbox mit verschiedenen Expressionsplasmiden mit unterschiedlichen Eigenschaften (z.B. verschiedene Signalsequenzen usw.) entwickelt. Mehrere Helferelemente dienen zur Optimierung der Expression, Löslichkeit oder Sekretion des rekombinanten Zielprodukts. Diese Elemente werden entweder als ein zweites Gen auf dem Expressionsplasmid eingeführt oder kodiert auf Helferplasmiden dem Expressionsplasmid hinzugefügt. Helferelemente umfassen cytoplasmatische Chaperone, Komponenten des Sekretionsapparates, periplasmatische Chaperone oder Faktoren zur Ausbildung von Disulfidbrücken.

Antikörperproduktion

Eine Herausforderung stellt die biotechnologische Produktion von Peptiden dar. Dies ist besonders interessant, weil die chemische Synthese größerer Peptide viele Schritte beinhaltet, was zu hohen Kosten führt. Ein Problem bei der biotechnologischen Herstellung mit E. coli stellt jedoch der Abbau von Peptiden durch Proteolyse dar. Daher hat Wacker Derivate des Sekretionsstammes entwickelt, bei denen Gene, die Proteasen kodieren, ausgeschaltet wurden. So kann das rekombinante Peptid unbeschadet durch die äußere Membran ins Kulturmedium gelangen.

Mehrere Proteine prokaryotischen und eukaryotischen Ursprungs konnten bereits in hohen Ausbeuten mit der Wacker-Sekretionstechnologie produziert werden (bis zu 10 g/L). Besonders bemerkenswert ist dabei die erfolgreiche Herstellung von funktionellen humanen Antikörperfragmenten mit korrekten Disulfidbrücken und Ausbeuten von über zwei Gramm pro Liter.

Kosten sinken

Produktions-Kosten sind ein wesentlicher Faktor bei der Herstellung von Biologics. Das Wacker-Sekretionssystem lässt sich zur Herstellung zahlreicher Proteine, Enzyme, Antikörperfragmente und Peptide anwenden. Die extrazelluläre Produktion erleichtert die Aufreinigung und macht langwierige Schritte zur Rückfaltung überflüssig. Dadurch wird die gesamte Herstellung effizienter und kostengünstiger.

Der Autor ist Geschäftsführer der Wacker Biotech GmbH.

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