Prozesschromatographie Neue Selektivitäten für die Prozesschromatographie

Autor / Redakteur: Dr. Dirk Sievers, Dr. Christina Bruntner / Anke Geipel-Kern

Die Fortschritte in der Biotechnologie haben die Anforderungen an pharmazeutische Produktionsprozesse spürbar verändert. Die in den vergangenen Jahren erzielten Leistungssteigerungen im Upstream-Bereich erfordern eine nachhaltige Optimierung der folgenden Aufreinigungsprozesse im Downstream-Bereich. Insbesondere im Hinblick auf die chromatographischen Methoden der Proteinaufreinigung ist ein Bedarf für leistungsstärkere Techniken entstanden, die die traditionellen Verfahren ergänzen. Welche Alternativen oder Weiterentwicklungen gibt es?

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Die HyperCel Mixed-Mode-Plattform zur Proteinaufreinigung ist in den industriellen Maßstab skalierbar. Bilder: Pall
Die HyperCel Mixed-Mode-Plattform zur Proteinaufreinigung ist in den industriellen Maßstab skalierbar. Bilder: Pall
( Archiv: Vogel Business Media )

Monoklonale Antikörper (Mabs) werden bevorzugt mittels Protein A Affinitätschromatographie gereinigt. Zurzeit gehören 35 Prozent aller Proteine, die sich in klinischen Studien befinden, zu dieser Antikörperklasse.

Ein wesentlicher Nachteil der Protein A Affinitätschromatographie ist der sehr hohe Preis pro Liter Sorbens. Die Industrie möchte diesen wesentlichen Kostenfaktor gerne senken. Protein-A-Sorbentien erfordern sehr saure Elutionsbedingungen (pH <3), wodurch die Gefahr einer unerwünschten Aggregatbildung oder Denaturierung der Zielproteine besteht.

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Darüber hinaus werden die Liganden mit zunehmender Säulenlebensdauer ausgewaschen, sodass sich Protein A in der Zielfraktion wiederfindet und später in einem Folgeschritt entfernt werden muss. Protein A Sorbentien sind zudem nicht vollständig mit 1 N NaOH als gebräuchlicher Regenerationslösung kompatibel, sodass mildere Regenerationsbedingungen erforderlich sind. Diese ermöglichen eine akzeptable Lebensdauer des Sorbens, erhöhen andererseits aber das Risiko unerwünschter Kreuzkontaminationen.

Die aufgeführten Aspekte verdeutlichen die vielseitigen Optimierungsansätze für die chromatographische Aufreinigung monoklonaler Antikörper. Hier liegt das große Potenzial der Mixed-Mode-Chromatographie.

Mixed-Mode-Sorbentien

Der Begriff Mixed Mode bezeichnet einen multiplen Retentionsmechanismus als Grundlage der Wechselwirkungen zwischen Probe und Sorbens. Schon in den 1970er Jahren experimentierten findige Forscher an ihren Universitäten mit ausgefallenen Mixed-Mode-Liganden, doch lagen kommerziell im Prozessmaßstab verfügbare Sorbentien damals noch in weiter Ferne. Mittlerweile hat sich das Bild verändert.

Mixed-Mode-Sorbentien haben massiven Zugang in die Prozessentwicklung gefunden. Ein Beispiel ist die in den industriellen Maßstab skalierbare HyperCel Mixed-Mode-Plattform zur Proteinaufreinigung. In der Praxis werden die Sorbentien bereits in Säulen mit einem Volumen von mehreren hundert Litern eingesetzt.

Monoklonale Antikörper reinigen

Das MEP-HyperCel-Sorbens eignet sich mit seinen maßgeschneiderten 4-Mercaptoethylpyridin-Liganden (Abb.1) insbesondere in Kombination mit der Ionenaustauschchromatographie als leistungsstarke Alternative zur Protein-A-Chemie. Die Liganden enthalten mit ihrem heterozyklischen Pyridinring und der Thioetherstruktur Elemente, die in dieser Kombination eine hohe Antikörper-Affinität aufweisen. Das Sorbens wurde speziell zur Aufreinigung monoklonaler Antikörper entwickelt und lässt sich für verschiedene Antikörperspezies und -subklassen einsetzen.

Der Retentionsmechanismus basiert primär auf hydrophoben Wechselwirkungen unter neutralen, „physiologischen“ Bedingungen (PBS, pH 7,4). Die Elution der Zielproteine erfolgt nach moderater pH-Senkung im Sinne eines Stufengradienten durch elek-trostatische Abstoßung gleicher (positiver) Ladungen. In der Regel reichen pH-Werte der mobilen Phase zwischen pH 4,5 und pH 4,0 aus. Stärker saure Bedingungen sind nicht erforderlich.

Das Sorbens ist unter Beladungsbedingungen nicht geladen, während die Proteine (partiell) positiv geladen vorliegen.

Die pH-Senkung bewirkt eine Ladungsinduktion durch Protonierung des Pyridinrings der Liganden und eine Verstärkung der Proteinladung. Dieser Mechanismus wird auch als Hydrophobic Charge Induction Chromatography (HCIC) bezeichnet. Als Folge ergibt sich die angesprochene elektrostatische Abstoßung gleicher (positiver) Ladungen. Sobald diese die hydrophoben Wechselwirkungen in ihrer Stärke übertrifft, lösen sich die Zielproteine von der Säule.

Der skizzierte Mixed-Mode-Mechanismus bietet in der Praxis wichtige Anwendungsvorteile. So erfordert die Elution die angesprochenen vergleichsweise milden pH-Werte im Bereich um pH 4,5 bis pH 4,0, während die Elution auf Protein-A-Sorbentien typischerweise eine pH-Senkung auf Werte von pH 3,0 (oder geringer) verlangt. Milde Elutionsbedingungen aber sind insbesondere für die große Antikörpergruppe von elementarer Bedeutung, die bereits ab pH 4,0 zu Aggregatbildung und Ausfällung neigt.

Das Sorbens ist darüber hinaus auch gegenüber harschen Regenerationsbedingungen resistent (1 N NaOH, 200 CIP Zyklen), woraus unmittelbar eine höhere Lebensdauer und eine Steigerung der Wirtschaftlichkeit folgt.

Die effiziente Gestaltung leistungsstarker chromatographischer Aufreinigungsverfahren im Downstream-Bereich biotechnologischer Produktionsprozesse setzt ein schnelles und verlässliches Screening potenziell geeigneter Sorbentien im Entwicklungsmaßstab voraus. Aus diesem Grund ist das Mixed-Mode-Sorbens in PRC-Fertigsäulen für den Labormaßstab verfügbar.

Die aus Polypropylen gefertigten Säulen(1 ml, 5 x 50 mm) können an jedes handelsübliche Chromatographiesystem angeschlossen werden. Sie stellen eine Grundlage für die spätere Aufskalierung dar, da das Sorbens im Labor-, Pilot- und Produktionsmaßstab vefügbar ist. Die Fertigsäulen ergänzen die LRC-Leersäulen, die mit unterschiedlichen Innendurchmessern (10 mm, 15 mm, 25 mm und 50 mm) und Zylinderlängen (bis 750 mm Betthöhe) für die nächste Skalierungsstufe (bis 900 ml Bettvolumen) erhältlich sind.

Zusammenfassung

Die HyperCel Mixed-Mode-Plattform bietet neue Selektivitäten zum Proteincapture aus unverdünnten Feedstreams. Das Mixed-Mode-Sorbens MEP HyperCel eignet sich hervorragend zur kosteneffizienten Aufreinigung monoklonaler Antikörper. Die biopharmazeutische Produktion erhält damit ein neues Werkzeug zur effizienten und wirtschaftlichen Proteinaufreinigung im Prozessmaßstab.

Hintergrund: Effektivität und Wirtschaftlichkeit sind gefragt

Die Chromatographie zählt zu den kostspieligsten Arbeitsschritten in der Biotechnologie. Daher stehen bei der Aufreinigung therapeutischer Proteine maximale Effizienz und Wirtschaftlichkeit im Fokus der Prozessentwicklung, betont Dr. Dirk Sievers, Marketing Manager bei Pall.

Welche chromatographischen Schritte charakterisieren gängige Aufreinigungskonzepte für therapeutische Proteine im Downstream Processing?

Dr. Dirk Sievers: Ein solches Konzept umfasst in der Regel eine Serie aufeinander folgender chromatographischer Arbeitsschritte, die sich grob in die Teilbereiche Capture, (Intermediate) Purification und Polishing aufteilen lassen. Der initiale Capture-Schritt verfolgt primär die Aufkonzentrierung des Zielproteins durch Abtrennung von Wasser als „Hauptverunreinigung“. Darüber hinaus soll das Zielprotein in eine stabilisierende, proteasefreie Umgebung überführt werden. Somit ist neben einer hohen dynamischen Bindungskapazität des chromatographischen Mediums der Faktor Geschwindigkeit von großer Bedeutung. Der intermediäre Purification-Schritt dient der eigentlichen Aufreinigung, sodass an dieser Stelle eine ausgezeichnete Auflösung selbst strukturell ähnlicher Verbindungen (z.B. Aggregate oder Missfaltungen) gewährleistet sein sollte. Der abschließende Polishing-Schritt sorgt schließlich für den finalen Feinschliff, d.h. die Entfernung verbliebener Spurenverunreinigungen (DNA, Endotoxine, Viren, Wirtszellproteine). Das Zielprotein muss am Ende des Aufreinigungsprozesses in maximaler Ausbeute und höchster Reinheit vorliegen.

Welche chromatographischen Aufreinigungstechniken werden vorrangig angewendet?

Dr. Sievers: Als chromatographische Aufreinigungstechniken haben sich insbesondere die Affinitätschromatographie (AC), die Ionenaustauschchromatographie (IEX) und die Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) etabliert. Sie bieten dem Anwender wichtige Leistungsvorteile, lassen aber dennoch Spielraum für Verbesserungen. Insbesondere die stark gestiegenen Proteinausgangskonzentrationen und Zellkulturvolumina erzwingen ein Umdenken. Außer diesen prozesstechnischen Überlegungen spielen wirtschaftliche Faktoren eine entscheidende Rolle, da die Chromatographie zu den kostspieligsten Arbeitsschritten in der Biotechnologie zählt. Die Entwicklung neuer Prozesse, die effizient und wirtschaftlich zugleich ausgelegt sein sollten, ist folglich eine der ganz großen Herausforderungen im biopharmazeutischen Umfeld.

Sehen Sie Optimierungsmöglichkeiten?

Dr. Sievers: Die aufgeführten chromatographischen Aufreinigungsverfahren bieten dem Anwender viele wertvolle Handhabungsvorteile. Andererseits bestehen kritische Schwachstellen, deren Überwindung neue Perspektiven in der Prozessentwicklung und -führung eröffnen könnte. Dazu gehören der Verzicht auf drastische pH-Werte zum Erhalt der biologischen Integrität der Zielproteine, die Begrenzung der erforderlichen Feedstockverdünnung vor dem initialen Protein Capture, die Auflösung von Proteinen mit ähnlichen Eigenschaften (Hydrophobizität & pI), eine Senkung der Konzentration kritischer Salze (z.B. Ammoniumsulfat), die Vereinfachung der Regeneration (Kompatibilität mit 1 N NaOH), eine Minimierung der Anzahl an Umpufferungsschritten und schließlich die Senkung der Aufreinigungskosten. Die Auflistung, die im übrigen keinen Anspruch auf Vollständigkeit erhebt, darf als Wunschliste der biopharmazeutischen Industrie angesehen werden. Sie spricht alle bereits erwähnten Spielarten der Prozesschromatographie an, darunter die Affinitätschromatographie mittels Protein A, die im vorliegenden Artikel näher betrachtet wird.

Der Autor ist Marketing Manager, die Autorin ist Separation Technology Specialist bei Pall GmbH Life Sciences, BioPharmaceuticals Central Europe

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