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Chromatographie Mixed-Mode als Alternative zur Hydrophoben Interaktionschromatographie

Autor / Redakteur: Dr. Dirk Sievers, Dr. Christina Bruntner / Anke Geipel-Kern

Die Aufreinigungsprozesse im Downstream-Bereich biotechnologischer Produktionsverfahren stehen im Mittelpunkt der Optimierungsstudien vieler pharmazeutischer Unternehmen. Sie sind infolge der Leistungssteigerungen im Upstream-Bereich zwingend notwendig geworden. Insbesondere im Hinblick auf die chromatographischen Methoden zur Aufreinigung therapeutischer Proteine steigt die Nachfrage nach leistungsstärkeren Techniken, welche traditionelle Verfahren ergänzen.

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Die HyperCel Mixed-Mode-Plattform zur Proteinaufreinigung ist in den industriellen Maßstab skalierbar.
Die HyperCel Mixed-Mode-Plattform zur Proteinaufreinigung ist in den industriellen Maßstab skalierbar.
( Bild: Pall )

Die Chromatographie zählt neben der Virusfiltration zu den mit Abstand kostenintensivsten Arbeitsschritten in der Biotechnologie. Sie erreicht in vielen Unternehmen einen Anteil von 40 bis 60 Prozent an den Gesamtkosten des biotechnologischen Prozesses (Upstream und Downstream). In Verbindung mit der steigenden Anzahl biotechnologisch hergestellter Arzneimittelkandidaten, die derzeit in klinischen Studien untersucht werden, machen diese Daten die Notwendigkeit einer optimalen Prozessgestaltung verständlich.

Mixed-Mode als Alternative

Eine interessante Option stellen moderne Mixed-Mode Sorbentien dar, die neue Selektivitäten zum Proteincapture und der Kontaminantenabtrennung aus unverdünnten Feedstreams bieten. Insbesondere in Kombination mit der Ionenaustauschchromatographie eignen sie sich als leistungsstarke Alternative zur Protein A-Chemie, die in vielen Unternehmen zur Aufreinigung monoklonaler Antikörper etabliert ist. Darüber hinaus bieten sie wichtige Leistungsvorteile gegenüber der klassischen Hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC), die nachfolgend näher betrachtet werden sollen.

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Die Hydrophobe Interaktionschromatographie erfordert zwingend die anfängliche Zugabe großer Mengen anti-chaotroper Salze. Sie sorgen dafür, dass dem Protein die Hydrathülle entzogen wird, sodass die im Inneren liegenden hydrophoben Seitenketten der Aminosäuren freigelegt werden. Auf diese Weise wird die Voraussetzung für die Retention des Proteins durch die ebenfalls hydrophoben HIC-Liganden (z.B. Octyl, Butyl, Phenyl) geschaffen. Im industriellen Maßstab sind diese massiven Salzmengen, oftmals Ammoniumsulfat (bis 3 M), ein Alptraum. Sie fördern die Korrosion der Säulenhardware und müssen später aus der Zielfraktion wieder entfernt werden. Darüber hinaus entstehen zusätzlicher Arbeitsaufwand und Kosten für das Recycling der ökologisch problematischen Ammoniumverbindungen.

Die synthetischen Mixed-Mode-Sorbentien MEP HyperCel, HEA HyperCel und PPA HyperCel (Abb.1), deren Liganden auf einer robusten Matrix verankert sind, umgehen diese Probleme. Ihr Retentionsmechanismus basiert vorrangig auf hydrophoben Wechselwirkungen unter neutralen („physiologischen“) Bedingungen (PBS, pH 7,4). Sie sind deutlich hydrophober als klassische HIC-Sorbentien, sodass die HIC-typische Zugabe bindungsfördernder Salze in hoher Konzentration entfällt und deren Entsorgungskosten erheblich gesenkt werden. Andererseits sind alle HyperCel Mixed-Mode-Sorbentien mit diesen bindungsfördernden Salzen vollständig kompatibel, sodass diese zur Retentionsverstärkung sehr wohl eingesetzt werden können. Im Falle einer nicht befriedigenden Bindungskapazität lässt sich somit das Retentionsverhalten optimieren.

Nach moderater pH-Senkung der mobilen Phase auf Werte zwischen pH 4,5 und pH 4,0 eluiert das Zielprotein durch elektrostatische Abstoßung positiver Ladungen. Stärker saure Bedingungen sind nicht erforderlich. Die Chromatographie wird somit über den pH-Wert und in Abhängigkeit des isoelektrischen Punktes der Proteine in vorhersagbarer Weise gesteuert. Im Falle klassischer HIC-Sorbentien ist das Verhalten nicht in ähnlicher Weise vorhersehbar. Das einheitliche HyperCel-Funktionsprinzip vereinfacht außerdem die Methodenentwicklung.

Als Faustregel gilt: je höher der isoelektrische Punkt, desto früher die Elution. Infolge ihrer Struktur eluieren basische Proteine daher vor sauren Proteinen. Hinzu kommt, dass sich hydrophilere Proteine leichter als hydrophobere Proteine von der Säule lösen lassen. In der Praxis werden die Zielproteine somit nach basischeren und hydrophileren Kontaminanten von der Säule gespült, während saurere und hydrophobere Verunreinigungen auf dem Sorbens verbleiben und sich in der Regenerationsphase bequem entfernen lassen. Aggregate, die generell hydrophober als das entsprechende Monomer sind, können auf diese Weise sicher abgetrennt werden, da sie infolge der stärkeren Wechselwirkung mit dem Sorbens zeitlich nach dem monomeren Zielprotein eluieren (Abb. 2).

Die Wiederfindung des Zielproteins erfolgt typischerweise in verdünntem Puffer oder einer mobilen Phase mit signifikant niedrigerer Salzkonzentration als im Falle konventioneller HIC-Anwendungen. Im erstgenannten Fall, in dem das Zielprotein in verdünntem Puffer (ohne bindungsfördernde Salze) wiedergewonnen wird, ist bestenfalls eine einfache pH-Modifikation erforderlich. Ein nachfolgender Diafiltrationsschritt ist nicht notwendig. Im letztgenannten Fall, in dem das Zielprotein in einem Puffer mit bindungsfördernden Salzen in relativ niedriger Konzentration wiedergewonnen wird, mag eine nachfolgende Diafiltration notwendig werden, doch kann auch eine einfache Verdünnung in Einzelfällen sehr wohl ausreichend sein.

Alle HyperCel Mixed-Mode Sorbentien sind gegenüber harschen Regenerationsbedingungen (1 N NaOH, 200 CIP Zyklen) resistent. Dadurch erhöht sich die Lebensdauer und die Produktion wird wirtschaftlicher. Dank der milden chromatographischen Bedingungen bleibt die biologische Funktionalität der Zielproteine weitestgehend erhalten. Die Sorbentien, die für den Labor-, Pilot- und Prozessmaßstab konzipiert wurden, werden in der Praxis bereits in Säulen mit einem Volumen von mehreren hundert Litern eingesetzt. In Tabelle 1 sind wichtige chemisch-physikalische Eigenschaften zusammengefasst.

Anwendung in der Praxis

Ein Anwendungsbeispiel ist die Aufreinigung monoklonaler Antikörper, die MEP HyperCel anstelle konventioneller HIC-Sorbentien nach dem initialen Proteincapture mittels Protein A einsetzt. Vorteil dabei: Da das neutralisierte Protein A-Eluat ohne vorherige Salzzugabe auf die Säule aufgegeben werden kann, vereinfacht sich der Prozessfluss. Das Zielprotein lässt sich anschließend mit verdünnter Pufferlösung eluieren und nach pH-Modifikation ohne zwischengeschaltete Diafiltration auf eine nachfolgende Anionenaustauschersäule aufbringen.

Im Entwicklungsmaßstab ermöglicht eine Auswahl an PRC-Fertigsäulen fürs Labor ein schnelles und verlässliches Sorbentienscreening. Die 1 ml Säulen (5 x 50 mm) sind mit allen HyperCel Mixed-Mode-Sorbentien verfügbar. Ebenfalls verfügbar sind die LRC-Leersäulen, die mit unterschiedlichen Innendurchmessern (10 mm, 15 mm, 25 mm und 50 mm) und Zylinderlängen (bis 750 mm Betthöhe) für frühe Aufskalierungsstudien geeignet sind.

Zusammenfassung

Die HyperCel Mixed-Mode-Plattform bietet neue Selektivitäten zum Proteincapture und der Kontaminantenabtrennung aus unverdünnten Feedstreams. Sie eignet sich insbesondere zur Aufreinigung monoklonaler Antikörper und anderer rekombinanter Proteine. Alle HyperCel Sorbentien lassen sich als HIC-Alternative in Abwesenheit hoher Salzkonzentrationen einsetzen. Die Wiedergewinnung der Zielproteine in verdünntem Puffer oder einer mobilen Phase mit signifikant niedrigerer Salzkonzentration kann eine nachfolgende Diafiltration überflüssig machen. Die biopharmazeutische Produktion erhält damit neue Werkzeuge zur effizienten und wirtschaftlichen Proteinaufreinigung im Prozessmaßstab.

Der Autor ist Marketing Manager, die Autorin ist Separation Technology Specialist bei Pall GmbH Life Sciences, BioPharmaceuticas Central Europe.

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