Pharmazeutische Wirkstoffanalytik Gleichzeitige Bestimmung von Wirkstoff und Verunreinigungen mit HPLC und UV-Detektion

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Die Identifizierung, Bestimmung und Zuordnung von Verunreinigungen ist in der Pharmaindustrie ein Muss. Da dies aufgrund der stark unterschiedlichen Konzentrationen und der Gegebenheiten eines UV-Detektors in der HPLC meist nicht in einer einzigen Messung zu realisieren ist, wurden bisher zwei Messungen benötigt: eine zur Bestimmung des Wirkstoffs und eine zum Nachweis der Verunreinigungen. Ab sofort genügt hierfür ein Messlauf.

Bei jeder Herstellung von Wirkstoffen entstehen Verunreinigungen, abhängig von der Produktionsweise in unterschiedlichem Ausmaß und Art. Diese Kontaminationen besitzen in manchen Fällen mitunter cancerogene oder schädigende Wirkungen. Statt zu helfen, würde das Medikament schaden.

Immer wieder finden sich Fälle in der Weltpresse, bei denen es nach der Verlegung einer Produktionsstätte zu Komplikationen mit Verunreinigungen, neuen Nebenwirkungen oder selbst Todesfällen gekommen ist. Daher ist nicht nur die Qualitätskontrolle von bestehenden Rezepturen von großer Wichtigkeit. Bereits in der langen Phase der Entwicklung eines neuen Präparats ist die Zuordnung und Bestimmung der Kontamination ein Muss. Schon beim Screening nach potenziellen Wirkstoffen werden Nebenprodukte bestimmt und die Zielsubstanzen isoliert.

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Diese Analytik nimmt in allen Arbeitsabläufen einen großen Teil der Zeit in Anspruch und ist somit ein nicht zu vernachlässigender Faktor. Wird sie schneller, lassen sich mehr potenzielle Wirkstoffe scannen, neue Präparate schneller entwickeln und Produktionsprozesse beschleunigen. Im Folgenden werden diese neuen Lösungen und Verfahren gezeigt.

Bestimmung von Verunreinigungen mit HPLC und UV-Detektion

Oft werden die Verunreinigungen und der Wirkstoff in verschiedenen HPLC-Methoden gemessen. Dies liegt mitunter an ihren stark unterschiedlichen Konzentrationen. So legen die ICH-Guidelines der Europäischen Arzneimittel-Agentur, wie in Tabelle 1 gezeigt (siehe Bildergalerie), für neue medizinische Substanzen verschiedene Grenzwerte für das Reporting, die Identifikation und die Qualifikation fest. Je nach Aufnahmemenge liegt z. B. der Grenzwert der Identifizierung bei ≤2 g/Tag bei 0,10 % und >2 g/Tag bei 0,05 % [1]. Diese niedrigen Level machen oft die separate Bestimmung von Kontamination und Arzneistoff in verschiedenen Methoden nötig.

Mit dem neuen Photodiodenarray-Detektor SPD-M40 von Shimadzu wurden einige Neuerungen eingeführt, die dieser Problematik entgegentreten. Durch das neue Design wurde störendes Streulicht komplett eliminiert, was einen erweiterten linearen Bereich, eine höhere Sensitivität und ein geringeres Signal-Rausch-Verhältnis liefert.

Die Linearität wurde anhand eines Ketoprofen-Präparats überprüft. Es wurden Standardlösungen im Bereich von 0,5 bis 800 mg/l hergestellt und gemessen. Die analytischen Konditionen zeigt Tabelle 2. In Abbildung 1 sind die unterschiedlichen Messungen übereinandergelegt und in Abbildung 2 die Flächen gegen die Konzentration zu einer Kalibrationsgeraden aufgetragen. Selbst über diesen weiten Kalibrationsbereich wird ein Bestimmtheitsmaß von R²: 0,9998 erreicht.

Mit dieser großen Linearität wird bei genauerem Zoom in die Messungen des z.B. 700 mg/l Ketoprofen-Standards der Vorteil bei der Bestimmung der Verunreinigungen sichtbar (siehe Abbildung 3). Selbst Kontaminationen mit <0,1% der Hauptpeakfläche sind problemlos mit geringen Standardabweichungen zu identifizieren. Verunreinigung 1 ist mit einer Konzentration von 0,126 % die Einzige, die identifiziert werden muss und besitzt eine Standardabweichung von 0,598 % RSD.

Zweite Messung überflüssig

Da die Verunreinigungen und der Hauptwirkstoff in einem Chromatogramm bestimmt werden können, ist eine zweite Messung überflüssig. Dies bietet ein enormes zeitliches Einsparpotenzial von bis zu 50 %. Reicht der kalibrierte Konzentrationsbereich nicht aus, kann mit dem Software-Feature i-DReC der LabSolutions LC der Kalibrationsbereich erweitert werden.

Ist ein Peak spektral rein, ändert sich mit der injizierten Konzentration lediglich die Intensität des UV-Spektrums, nicht aber der Verlauf. Unter normalen Umständen wird zur Steigerung der Nachweisgrenze immer bei der Wellenlänge der maximalen Absorption gemessen. Kommt der Detektor in den Bereich der Sättigung, ist eine Abflachung der Kalibrationskurve zu sehen. Ab diesem Punkt wird der nicht-lineare Bereich verlassen, der in Abbildung 4 (blauer Bereich) anhand eines Beispiels veranschaulicht ist.

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Mit der Funktion i-DReC wird dann ab da automatisch ein zweites Maximum des UV-Spektrums der Zielverbindung verwendet, das eine geringere Intensität besitzt. Der Detektor befindet sich nicht mehr in der Sättigung und im linearen Bereich. Da sich der Verlauf nicht ändert, ist das Verhältnis der Intensitäten der beiden Punkte klar definiert. Mit diesem Faktor erfolgt die Umrechnung zwischen den beiden verwendeten Wellenlängen, und die Kalibrationsgerade kann in höhere Konzentrationen erweitert werden.

Verbesserte Nachweisgrenze der Verunreinigungen

Das Ergebnis dieser Operation zeigt Abbildung 4. Die Kalibrationsgerade ist bis in hohe Konzentrationen linear mit einem Korrelationsfaktor von R: 0,9996726. Wird dies auf einen beispielhaften pharmazeutischen Wirkstoff angewendet (Abbildung 5), kann er in viel höherer Konzentration injiziert werden, was die Nachweisgrenze der Verunreinigungen entschieden verbessert. Die Ergebnisse dieser Messung fasst Tabelle 4 zusammen. Verunreinigungen < 0,5% des Hauptpeaks können noch sehr gut und mit einer Standardabweichung %RSD von < 0,9 gemessen werden.

Oft kommt es vor, dass zwei Substanzen nicht basisliniengetrennt sind, aber quantifiziert werden sollen. Sind die Chromatogramme allerdings sehr komplex, ist dies mitunter eine zeitintensive Angelegenheit, die nicht oft von Erfolg gekrönt ist. Mit dem Software-Feature i-PDeA können zwei coeluierende Substanzen mathematisch getrennt werden, solange sich ihre UV-Spektren unterscheiden. Dazu legt man die sich unterscheidenden UV-Spektren der Einzelsubstanzen zugrunde. Dies ist exemplarisch anhand der Messung von Difluorobenzophenon (DFBP) und Valerophenon (VP) in Abbildung 6 gezeigt. Das Ergebnis sind zwei getrennte Detektorkanäle, mit dem jeweiligen abgetrennten Peak, der nun sehr einfach quantifiziert werden kann.

Neue Applikationsmöglichkeiten

Die Vereinigung dieser Eigenschaften schafft neue Anwendungsgebiete in der HPLC mit UV-Detektion. Die Anzahl an Messungen für eine Probe kann auf eine einzige reduziert werden, und die HPLC steht für weitere Messungen zur Verfügung. Da der Detektor SPD-M40 zusammen mit den Software-Features in einer validierten Software, die den Anforderungen wie der Datenintegrität im regulierten Umfeld entspricht (z.B. 21 CFR Part 11), gesteuert werden kann, sind diese Merkmale auch für regulierte Bereiche verfügbar.

Dies kann auch für noch nicht-regulierte Bereiche, wie die Forschungs- & Entwicklungsabteilungen in der analytischen Entwicklung von großem Interesse sein, da der compliance program guide 7346.832 im September 2019 durch die FDA erneuert wurde und ab September 2022 zum Tragen kommt [2]. Ab diesem Zeitpunkt werden erweiterte Anforderungen an die Datenintegrität, Chromatographie-Datenbanksysteme und die Software-Validation gestellt.

Zusammenfassung

Neue Entwicklungen und Features bieten jederzeit großes Potenzial, bestehende Prozesse zu optimieren und Ressourcen einzusparen. Mit der erweiterten Linearität, dem geringen Signal-Rausch-Verhältnis und neuen Software-Features, wie dem i-DReC der LabSolution LC, kann die Bestimmung von Verunreinigungen und Wirkstoffen in einer einzigen Messung erfolgen. Dies bietet neben der Zeitersparnis den weiteren Vorteil, dass die Ergebnisse der Kontaminationen immer klar der gemessenen Probe zugeordnet werden kann. Durch weitere Funktionen wie z.B. der Peak Purity kann die spektrale Reinheit der Peaks bestimmt werden und so etwaige UV-absorbierende Verunreinigungen ausgeschlossen werden. Da die Steuerungssoftware den Anforderungen der 21 CFR Part 11 entspricht, sind diese Funktionen auch in der Routine der streng regulierten Bereiche zugänglich.

Literatur:

[1] European Medicines Agency, ICH Topic Q3A (R2), “Note for Guidance on impurities testing: impurities in new drug substances” Oktober 2006, CPMP/ICH/2737/99

[2] FDA Chapter 46: Compliance Program 7346.832: Pre-Approval Inspections/Investigations

* Der Autor ist Produktspezialist HPLC bei der Shimadzu Deutschland GmbH.

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