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Massenspektrometrie Neues Verfahren eröffnet umfassende Stoffwechselanalysen

Autor / Redakteur: Aleš Svatoš* / Marc Platthaus

Forscher des Max-Planck-Instituts für chemische Ökologie in Jena haben zusammen mit Kollegen der Tschechischen Akademie der Wissenschaften in Prag eine neue Methode entwickelt, die aus Gewebeproben von Tieren oder Pflanzen Stoffwechselprodukte wie Fettsäuren, Aminosäuren, Zucker oder andere organische Stoffe schnell und zuverlässig nachweisen kann. Das Verfahren basiert auf klassischer Massenspektrometrie (MALDI-TOF/MS), nutzt hierbei aber eine neue Art von Matrix.

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1 Das Funktionsprinzip der MALDI-MS-Methode. (Bilder: Max-Planck-Institut für chemische Ökologie)
1 Das Funktionsprinzip der MALDI-MS-Methode. (Bilder: Max-Planck-Institut für chemische Ökologie)
( Archiv: Vogel Business Media )

Die Metabolomik ist ein derzeit hoch aktuelles und schnell wachsendes Analysegebiet. Bei ihm dienen Metabolite als charakteristische Marker, um den Zustand eines studierten Organismus zu beschreiben. Solche Substanzen werden im hohen Durchsatz und in einer breiten Skala an Konzentrationen gemessen. Sie können auch zur Krankheitsdiagnose eingesetzt werden: Hier wird der Unterschied zum „normalen“ Metabolitenprofil bestimmt. Eine vergleichsweise neue Disziplin der Metabolomik, die Lipidomik, konzentriert sich auf Lipide als biologisch signifikante Marker für die Diagnostik von Infektionskrankheiten und untersucht die Reaktion des Organismus auf umwelttechnische Einflüsse. Diese Untersuchungen und die taxonomische Klassifizierung der Arten führten zu einem dramatischen Anstieg in der Bestimmung von komplexen Lipiden. Dennoch hängen solche Analysen von „Niedrigdurchsatz-Methoden“ wie Gaschromatographie (GC) mit Elektronionisierung-Massenspektrometrie (EI/MS) oder von der chemischen Ionisierung (CI/MS) ab. Außerdem sind aufwändige Probenvorbereitungsschritte nötig.

Die großen Fortschritte der Elektrospray-Ionisierung-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (ESI-LC/MS) von polaren Lipiden brachten hier in den letzten Jahren einige Vorteile. Eine weitere Möglichkeit zur Ionisierung von Fettsäuren ist die MALDI-MS. Für die Analyse von niedrigmolekularen Substanzen (<1000 Da) wird die Hochmolekulargewicht-Matrix Meso-tetrakis(pentafluorophenyl)porphyrin (Mr etwa 974 Da) verwendet. Sie kann allerdings nur für die Analyse von gesättigten Fettsäuren eingesetzt werden. Daher wurden mehrere Matrix-freie Methoden entwickelt, wie die Desorption und Ionisierung auf porösem Silizium (DIOS-MS) zur Analyse von deprotonierten Fettsäure-Ionen. Nachteile der DIOS-Methode sind ihre noch zu niedrige Sensitivität (im hohen Pikomolbereich) und die häufig beo-bachtete Generierung von kationischen Zweifach-deprotonierten FA Dimeren/Trimeren. Auch Graphit-Oberflächen dienen zur Analyse von Fettsäuren in unterschiedlichen Ölen. Das Fehlen von Hochdurchsatzmethoden für die Untersuchung von Fettsäuren führte am MPI Jena zur Entwicklung von neuen Matrices für die direkte Säure-Analyse und allgemein für den Nachweis von leicht sauren Analyten.

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MALDI-TOF/MS für den Nachweis von kleinen Molekülen?

Die Massenspektrometrie ist ein Analyseverfahren zur Bestimmung chemischer Verbindungen und dient der Aufklärung der molekularen Zusammensetzung und Struktur. In der modernen Biologie werden verschiedene massenspektrometrische Verfahren eingesetzt, besonders für die Analyse großer Moleküle. Im MALDI-Verfahren (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) werden beispielsweise Proteine zusammen mit einer bestimmten Substanz (der Matrix) ko-kristallisiert und durch Laserbestrahlung in kleine Protein-Ionen zerlegt (s. Abb. 1). Während der Bestrahlung funktionieren die Matrix-Moleküle als Energieabsorber und übertragen diese zu den Analytenmolekülen, die so ionisiert werden. Die entstandene Gaswolke besteht meistens aus [M+H]+-Ionen (im Falle eines addierten Wasserstoffes) oder aus [M-H]--Ionen (im Falle einer Eliminierung des Wasserstoffes). Die Messung ergibt eine Abhängigkeit der Masse zum Ladezustand-Verhältnis gegen die Intensität der beo-bachteten Ionensignale.

Die im MALDI-Verfahren eingesetzten Feststoff-Matrices haben jedoch einen wesentlichen Nachteil: Das Laserlicht erzeugt nicht nur Ionen aus dem Probegemisch, sondern auch aus der Matrix entstehen Ionen mit kleinen Massen (< 500 Da). Wegen dieser störenden, interferierenden Ionen (s. Abb. 2 links) konnten kleine Moleküle, die im Metabolismus von Lebewesen eine Rolle spielen, nicht analysiert werden. Die aus herkömmlichen Matrices stammenden Ionen stellten quasi einen Heuhaufen dar, in dem ein paar wichtige Nadeln gefunden werden sollten. Für das moderne Gebiet der „Metabolomics“ war also die MALDI-Technik nur begrenzt anwendbar. Erste Arbeiten am MPI wurden mit stark basischen MALDI-Matrices (z.B. 9-Aminoakridin) für die Bestimmung von kleinen organischen Säuren mit einer sehr guten Sensitivität durchgeführt. Doch auch hier wurden mehrere interferierende Ionen beobachtet und stellten daher das Design neuer Matrices in den Vordergrund.

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