Worldwide China Indien

Kopplungstechniken

Deutsche Analytik Tage – Treffpunkt für Chromatographie

16.05.2007 | Autor / Redakteur: olaf Spörkel* / Marc Platthaus

Am 8. und 9. Mai fanden im Vogel Convention Center (VCC) in Würzburg die ersten Deutschen Analytik Tage statt. Unter dem Leitmotiv „Kopplungstechniken und schnelle Chromatographie“ trafen sich Vertreter aus Universitäten, Instituten und Industrie, um sich über neueste Entwicklungen zu informieren und aktuelle Fragen zu diskutieren. (Hier finden Sie ausführliche Informationen sowie ein Online-Anmelde-Formular zu den Deutschen Analytik Tagen 2008.)

Die Chromatographie gehört zu den wichtigsten und ältesten Techniken in der Analytik. Anfang des zwanzigsten Jahrhunderts von dem russischen Botaniker Michael S. Tswett zur Trennung von Farbstoffen aus Pflanzen erstmals angewendet, hält das Trennverfahren auch heute noch innovative Entwicklungen bereit.

Dies gilt besonders für GC/MS- und HPLC/MS-Kopplungstechniken und für die Verkürzung chromatographischer Trennzeiten. Kopplungstechniken und schnelle Chromatographie waren daher auch die Themen der ersten Deutschen Analytik Tage in Würzburg.

Bernward Rittgerodt von Brimus Schwangau – mit über 40 Jahren Erfahrung in der Chromatographie selbst an diversen Neuentwicklungen beteiligt – führte als Moderator durch die Tagung, die sich aus sechs Plenar- und 16 Firmenvorträgen sowie einer hochkarätig besetzten Podiumsdiskussion mit den Rednern der Plenarvorträge zusammensetzte. Nicht nur im Rahmen der Podiumsdiskussion stellte er zentrale Fragen wie: „Welche Kopplungstechniken sind praktisch relevant und wo liegen die Vorteile?“ oder „Was heißt schnelle Chromatographie und wie schnell muss sie sein?“

Wo stehen die HPLC und GC heute?

Einen Überblick über Entwicklung und derzeitige Anforderungen an die GC und HPLC gab Prof. Dr. Thomas Welsch vom Institut für Analytische Chemie und Umweltchemie, Ulm in seinem Plenarvortrag „Stand in der Gas- und Flüssigkeitschromatographie“. Die Frage nach Schnelligkeit und das Verlangen nach möglichst kurzen Analysenzeiten entwickelten sich erst nach und nach, wie Prof. Welsch überzeugend darlegte. Seinen Ausführungen entsprechend lag die Herausforderung zunächst in der ausreichenden Auflösung der einzelnen Komponenten. Im Gegensatz zur HPLC habe sich die GC sehr schnell zu einer robusten und flexiblen Trennmethode entwickelt, mit der sich komplexe Stoffgemische durch hohe Trennstufenzahlen separieren ließen. Laut Welsch sorgte besonders die Einführung kurzer Kapillarsäulen mit kleineren Innendurchmessern für eine höhere und schnellere Auflösung. Kapillargaschromatographische Trennungen etablierten sich bereits in den siebziger Jahren und zeichnen sich heute durch hohe Geschwindigkeit, Effizienz und geringe Probenverdünnung aus. Demgegenüber entwickelte sich die Flüssigchromatographie nur sehr schleppend. Die Reduktion der Partikeldurchmesser habe die Analysenzeiten zwar verkürzt und den Probendurchsatz gesteigert, aufgrund der begrenzten Trennstufenzahl sei die Auftrennung komplexer Gemische mit konventioneller HPLC jedoch nach wie vor nur begrenzt umsetzbar. Als mögliche Auswege aus diesem Dilemma stellte Welsch lange monolithische Säulen mit höherer Permeabilität, die 2D-HPLC und On-Chip-HPLC-Lösungen zur Auswahl. „Die Flüssigchromatographie mit druck- oder elektroosmotisch bewegter mobiler Phase integriert auf Chips stellt eine weitere interessante Entwicklungsrichtung und mögliche Alternative zur HPLC mit diskreten Säulen dar“, so Prof. Welsch.

Schnelligkeit und Effizienz gefragt

Die Frage nach Schnelligkeit und Effizienz in der Chromatographie stellte sich auch in der Podiumsdiskussion. Nach Ansicht von Prof. Dr. Andreas Rizzi vom Institut für Analytische Chemie und Lebensmittelchemie an der Universität Wien sei die erforderliche Schnelligkeit immer abhängig von der Applikation. In der Bioanalytik habe neben dem Trennprozess auch die Bioinformatik, Datenverarbeitung und Software eine entscheidende Bedeutung. Man könne mit extremer Geschwindigkeit riesige Datenmengen sammeln, benötige aber danach oft viel längere Zeit um daraus die wichtigen Informationen zu extrahieren. „Die Schnelligkeit der Trennung ist besonders dann wichtig, wenn in Mehrstufen-Trennprozessen wie der 2D-Chromatographie die Wiederholungszahlen der Analyse in der zweiten Dimension sehr groß sind.“ Ein Beispiel dafür sei die 2D-HPLC mit Säulenschalten im Anwendungsbereich der Proteomanalytik, so Rizzi.

Auch Prof. Dr. Michael W. Linscheid vom Institut für Chemie an der Humboldt-Universität Berlin gab zu Bedenken, dass die Zeitersparnis immer relativ betrachtet werden müsse. Auf die Frage nach den Vorteilen der Kopplungsmethoden erwiderte er, dass Kopplungstechniken ihre Vorteile beim Probenablauf hätten, man müsse allerdings auch hier differenzieren. „Es gibt mittlerweile wieder Entwicklungen, die der Online-Analytik entgegen laufen. Der Vorteil der Offline-Analyse ist, dass man ein Archiv anlegen kann. Nimmt man bei jedem Schritt ein Aliquot ab, erhält man eine Off-line-Referenz, kann daraus ein Archiv etablieren und weitere Analysen wie NMR oder ICP mit der gleichen Probe durchführen“, erklärte Linscheid.

Über extrem hohe Geschwindigkeiten mithilfe der Ultra-Fast-GC berichtete auch Dr. Klaus Schrickel von Thermo Fisher Scientific. Schrickel ging in seinem Vortrag zunächst auf die zugrunde liegende Technologie ein. Demnach erfolge bei der Ultra-Fast-GC die Beheizung der Säule direkt und erlaube dadurch Heizraten bis zu 1200 °C/min von 50 bis 370 °C und Abkühlraten von 350 °C auf 50 °C in weniger als 30 Sekunden. Anhand verschiedener Anwendungsbeispiele zeigte er, dass die Methode eine geringere Auflösung als die konventionelle GC hat, für die meisten Applikationen aber ausreichend sei.

Ein nicht ganz so schnelles, dafür aber druckvolles Verfahren beschrieb Marcus Wälz von Thermo Fisher Scientific. Wie Wälz darlegte, würde die Flüssig-Chromatographie mittels Accela U-HPLC (Ultrahochdruck-HPLC) und 1,9 µm Partikeln hohe Trennstufen und eine verbesserte Auflösung liefern. Die kleinen Partikelgrößen würden die Sensitivität steigern und schnellere Analysenzeiten ermöglichen.

Für eine Produkt-Premiere sorgte Sylvia Marten von Knauer. In ihrem Vortrag stellte sie erstmals in der Öffentlichkeit das neue Smartmix-System vor, das bei der Mischung von HPLC-Eluenten für eine genaue Gradientenbildung und kurze Verzögerungszeiten sorgen soll. Laut Marten arbeitet der Mischer unabhängig von der Flussrichtung und lässt sich für Niederdruck- als auch Hochdruckgradientensysteme einsetzen. Darüber hinaus enthält das Gerät einen Eluentenfilter und optionalen Flussteiler.

Bioanalytik und Proteinbestimmung

Am ersten Tag der Veranstaltung eröffnete Prof. Dr. Rizzi das Themenfeld der Biowissenschaften mit seinem Plenarvortrag „Hochleistungstrenntechniken in der Bioanalytik“. Rizzi beschrieb in seinem Vortrag die Chromatographie und Elektrophorese als miniaturisierbare und hochempfindliche Trennmethoden, die für Hochdurchsatzanalysen geeignet seien und sich für mehrdimensionale Trennungen und Kopplung mit unterschiedlichen Detektoren verbinden ließen. Nach Ansicht des Referenten resultieren die großen He-rausforderungen der Bioanalytik einerseits aus der Komplexität des Probenmaterials, was mehrdimensionale Trennungen erforderlich macht, andererseits aus der oft nur gering vorhandenen Probenmenge, weshalb Miniaturisierungen nötig sind und drittens benötige die Bioanalytik Hochdurchsatzlösungen mithilfe schneller Analysen und paralleler Abarbeitung der Proben.

Da biologische Proben in der Regel aus vielen Komponenten bestehen, fänden die Trennungen zur Erhöhung der Peakkapazität zunehmend mehrdimensional in mehreren Stufen statt. Kopplungstechniken mit Detektionssystemen, die teilweise selbst mehrstufig arbeiten, hätten große Bedeutung für bioanalytische Fragestellungen. Oft stehen nur wenige pico-Mol Protein zur Verfügung, sodass man in der Bioanalytik heute vorrangig mit Kapillar- oder Nanosäulen arbeite. Prof. Rizzi hob hervor, dass die Miniaturisierung den Vorteil einer geringen Probenverdünnung habe. So werden Systeme im Chipformat eingesetzt, die mehrdimensionale Chromatographie-Trennungen erlauben und mit Nano-Elektrospray-Ionisation kombinierbar sind. In seinem Vortrag ging Rizzi auch auf die Bedeutung der elektrophoretischen Trennmethoden ein. Demnach seien Trennungen im Kapillarformat sehr schnell durchführbar. Zudem liege die Anzahl der realisierbaren Trennstufen für hochgeladene Analyte im Bereich von einigen Hunderttausend bis zu einer Million pro Meter. Die Gelelektrophorese biete die Möglichkeit einer Größenauftrennung mit einer Auflösung, die in der Chromatographie kaum realisierbar ist.

In ihrem Vortrag über Proteinfraktionierungstechniken zeigte Verena Fraaß von der Universität des Saarlandes, dass sich mithilfe einer mehrdimensionalen chromatographischen Analyse Proteine auch in einem sehr breiten Konzentrationsbereich charakterisieren lassen. Die MS gewinne dabei als Detektionsmethode zunehmend an Bedeutung. Sie habe u.a. den Vorteil der sehr genauen Massenanalyse der untersuchten Proteine und gebe Hinweise auf posttranslationale Modifikationen.

Dr. Thomas Letzel von der TU München, Weihenstephan, stellte eine neue Methode vor, die MS nutzt, um enzymatische Aktivitäten zu messen. Letzel berichtete, dass mit der MS die klassischen Substanzmarkierungen überflüssig und die meisten geladenen Reaktionskomponenten vonei-nander unterscheidbar seien. Aktivitäten und Reaktionsverläufe ließen sich nach Ansicht des Vortragenden sensitiv und akkurat wiedergeben.

Kaj Petersen von Gerstel zeigte in seinem Vortrag eine Möglichkeit, wie man den Probendurchsatz in der Kapillar-GC durch schnelles Heizen und Kühlen steigern kann. Demnach erlaubt das neue Mach-Heizmodul (Modular Accelerated Column Heater), das auf Basis der LTM-Technologie (Low Thermal Mass) entwickelt wurde, schnelle Aufheizraten und eine beschleunigte Abkühlung. Die Zeitersparnis illustrierte Petersen u.a. an Beispielen aus der Pestizidanalytik. Sein Kollege Dr. Oliver Lerch, Gerstel-Applikationsspezialist, präsentierte neue Anwendungsbeispiele der automatisierten dynamischen-Headspace GC/MS-Analytik und automatisierten Festphasenextraktion (SPE) mit direkter Kopplung an die GC/MS oder LC/MS.

Auf Fragen zur quantitativen Bestimmung von Peptiden und Proteinen gab Prof. Dr. Linscheid neue Antworten. Er vermittelte dabei einen Überblick über Methoden zur Quantifizierung auf Protein- und Peptidebene und stellte Alternativen zu den Gel-basierten Proteinanalysemethoden vor. So verdeutliche beispielsweise die Icat-Methode (Isotope coded affinitytag), die auf Isotopenmarkierung basiert, dass Quantifizieren nicht nur wünschenswert, sondern auch nötig und möglich sei. Mit der neuen Mecat-Technologie (Metal coded affinity tagging), die von der Arbeitsgruppe Linscheid entwickelt wurde, seien relative und absolute Quantifizierungen von Proteinen und Peptidgemischen bis hinunter zu Attmol- bis Femtomolmengen möglich. Zur Markierung der einzelnen Proben werden Metalle eingesetzt, die nach der Auftrennung mittels induktiv gekoppelter Plasma Massenspektrometrie quantifiziert werden. Die „LC/ICP-MS und LC/Esi MS/MS sind ein ausgezeichnetes Gespann“, so Linscheid. Mit anschließender Maldi/Esi/MS lassen sich die Proteine identifizieren. Das Verfahren soll einen dynamischen Bereich von bis zu zwölf Größenordnungen abdecken, könne mehrere Zustände simultan messen und ermögliche quantitative Bestimmungen auch aus analytischen Gelen heraus. Linscheid präsentierte damit einen vielversprechenden Ansatz zur Messung absoluter Proteinmengen.

Speziell für die Trennung von polaren und hydrophilen Substanzen stellte Dr. Harald Dibowski von Sequant die hydrophile Interaktionschromatographie (Hilic) vor. So erlaube die Technik das Arbeiten mit einer polaren stationären Phase unter Verwendung von LC-MS kompatiblen, wässrigen Puffern. Mit dem Nachweis von Acrylamid in Lebensmitteln schilderte Dibowski ein typisches Anwendungsbeispiel des Phasenmaterials.

Miniaturisierung und Analytik

Prof. Dr. Uwe Karst vom Institut für Anorganische und Analytische Chemie an der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster beschrieb die Miniaturisierung und Kopplungstechniken als aktuelle Trends im Bereich der analytischen Trenntechniken. Sie sorgten einerseits für eine besonders schnelle Analytik und anderseits erhöhten sie die Selektivität deutlich, um auch komplexes Probenmaterial analysieren zu können. In seinem Vortrag „Kopplungstechniken und Miniaturisierung: Neue Perspektiven für die instrumentelle Analytik“ nahm Karst zu beiden Aspekten Stellung und legte einen besonderen Fokus auf elektrochemische Verfahren in der Metabolismusforschung. Obwohl elektroanalytische Verfahren (EC) bereits seit langem in Metabolismusstudien eingesetzt werden, ließen sich komplexe Proben noch immer nicht detailliert charakterisieren. Die Arbeitsgruppe um Prof. Karst hat zwischen elektrochemischem Verfahren und MS online eine flüssigchromatographische Trennung auf Umkehrphasen integriert. Bei dieser Kombination werden Isomere unterschiedlicher Polarität oder verschiedene Gruppen von Oxidationsprodukten gut aufgetrennt. Am Beispiel der Clozapin-Metabolitenanalytik demonstrierte Karst die Vorteile der etwas ungewöhnlichen Kopplungsmethode. Ein anderes Online-Verfahren von EC, LC und der NMR könnte detaillierte Einblicke in Strukturen erlauben, die bisher nicht möglich sind.

Die Kernresonanzspektroskopie war auch Thema des Plenarvortrags von Prof. Dr. Klaus Albert vom Institut für Organische Chemie in Tübingen. Albert stellte seine aktuellen Ergebnisse im Bereich der Online-Kopplung von HPLC und NMR vor. Nach Ansicht des Referenten ist das geschlossene HPLC-NMR-System gegenüber der Offline-Analytik mit wesentlichen Vorteilen verbunden. Neben dem Zeitgewinn lassen sich z.B. auch licht- und sauerstoffempfindliche Verbindungen problemlos untersuchen. Mithilfe der Kapillar-HPLC-NMR-Kopplung analysierte Albert u.a. die stereochemischen Eigenschaften von Tocopherolen (Vitamin E-Derivate) und Lycopenen (Carotinoide) in verschiedenen Matrizes. Anhand der 1H-NMR-Spektren ließen sich z.B. beta- und gamma-Tocopherol online voneinander differenzieren. Derzeit können Spektren von Verbindungen im Nanogramm-Bereich aufgenommen werden. Obwohl die NMR-Spektroskopie relativ unempfindlich ist, scheint es doch für viele Fragestellungen keine Alternativen zu geben. Beim Abdampfen des Lösungsmittels könne beispielsweise eine Isomerisierung empfindlicher Verbindungen eintreten. Hier zeige sich der Vorteil geschlossener Systeme, da man artefaktfrei Substanzen identifizieren könne. Die Offline-Analytik stabiler Metaboliten stelle dagegen nach Auffassung von Prof. Albert kein Problem dar.

Die Notwendigkeit der Kopplung mit der HPLC unterstrich Albert auch in der Podiumsdiskussion: „Im Bereich der Naturstoffanalytik benötigen wir auf jeden Fall neben der HPLC/NMR- die HPLC/MS-Kopplung. Ohne vorherige chromatographische Auftrennung ist eine reproduzierbare Analytik besonders im Nanogramm-Bereich kaum möglich“.

Chromatographie und Spektroskopie

Unter dem Gesichtspunkt Detektion schlug Prof. Dr. Günter Gauglitz vom Institut für Physikalische und Theoretische Chemie in Tübingen die Brücke zwischen Chromatographie und Spektroskopie. Gegenüber der Photometrie bieten spektrale Detektionsmethoden demnach eine teilweise Differenzierung der aufgetrennten Komponenten, ohne allerdings die Bestandteile eindeutig identifizieren zu können. Zum selektiven Nachweis einzelner Analyte befänden sich Kopplungsmethoden aus Biosensoren und Chromatographie bereits in der Entwicklung. Als Beispiel nannte Gauglitz den quantitativen Nachweis von Pestiziden mittels HPLC/Biosensoren. Neben der Chromatographie werden zunehmend auch elektrophoretische Verfahren mit Biosensoren gekoppelt. Er betonte, dass in diesem Bereich intensive Forschungen zu einer Vielzahl neuer Ansätze geführt habe: „Grundlage der neuen Anwendungen und Kopplungstechniken sind moderne Entwicklungen im Bereich der Spektroskopie, wie sie bei Chemo- und Biosensoren in den letzten Jahren erfolgreich eingeführt wurden.“

Auf der begleitenden Fachausstellung präsentierten 20 Hersteller ihre neuen Produkte und Applikationen und nutzten die Möglichkeit den regen Austausch mit Teilnehmern und Referenten zu suchen.

Die von den Teilnehmern einhellig als Erfolg charakterisierte Premiere der Deutschen Analytik Tage wird im nächsten Jahr ihre Fortsetzung finden. Im Juni 2008 wird das VCC in Würzburg wieder Treffpunkt für die Chromatographie-Experten sein.

*O. Spörkel, Labscience Communications, 85567 Grafing

Kommentare werden geladen....

Kommentar zu diesem Artikel abgeben

Der Kommentar wird durch einen Redakteur geprüft und in Kürze freigeschaltet.

  1. Avatar
    Avatar
    Bearbeitet von am
    Bearbeitet von am
    1. Avatar
      Avatar
      Bearbeitet von am
      Bearbeitet von am

Kommentare werden geladen....

Kommentar melden

Melden Sie diesen Kommentar, wenn dieser nicht den Richtlinien entspricht.

Kommentar Freigeben

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

Freigabe entfernen

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

copyright

Dieser Beitrag ist urheberrechtlich geschützt. Sie wollen ihn für Ihre Zwecke verwenden? Infos finden Sie unter www.mycontentfactory.de (ID: 211642 / Prozessmesstechnik)