Maldi-Tof-Massenspektrometrie ermöglicht schnellere Reaktionszeiten

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So funktioniert Maldi-Tof

Bei der Maldi-Tof-Methode wird eine geringe Menge Koloniematerial mit einer niedermolekularen Matrix (z.B. Alpha-cyano) auf einem metallischen Träger cokristallisiert. Diese Mischung wird mit einem Laser beschossen. Dadurch verdampft die Matrix explosionsartig und die zu untersuchenden Analytmoleküle – dabei handelt es sich v.a. um Ribosomenproteine (m/z = 2000 bis 20 000 Dalton) – werden mitgerissen. Es findet dabei gleichzeitig eine Ionisierung des Analyten statt.

Die entstandenen Ionen werden über ein elektromagnetisches Feld beschleunigt und in einem feldfreien Flugrohr definierter Länge dem Detektor zugeführt. Das Ionengemisch wird aufgetrennt, wobei kleinere, leichtere Ionen schneller am Detektor auftreffen. Dieser wandelt die ankommenden Ionen in ein elektrisches Signal um. Die ankommenden Signale werden in Abhängigkeit ihrer Flugzeit (Time Of Fight) zu einem Massenspektrum umgeschrieben. Da sich Mikroorganismen in ihren Massenspektren unterscheiden, bietet dies die Grundlage für eine Keimidentifizierung.

Bei Labor L+S wird die molekulare Identifizierung mit dem Massenspektrometer Vitek MS von Biomerieux durchgeführt. Die erhaltenen Spektren werden mit der Vitek MS-Industrie-Datenbank (Myla) ausgewertet und das Ergebnis angezeigt. Mithilfe der Schmiermethode wird etwas Koloniematerial von einer auf einem geeigneten Nährmedium kultivierten 24- bis 72-Stunden-Reinkultur auf eine Position eines „Targets“ übertragen. Dieses ist objektträgergroß und mit insgesamt 48 Proben- und drei Kalibrierspots versehen, wobei diese in drei Erfassungsgruppen unterteilt sind, d.h. jeweils 16 Probenspots und ein Kalibrierspot bilden eine Erfassungsgruppe.

Dies hat den Vorteil, dass ein Target, das noch freie Erfassungsgruppen hat, mehrmals verwendet werden kann. Jeweils am Anfang und Ende einer Erfassungsgruppe erfolgt eine Kalibrier- bzw. Referenzmessung mit E. coli-Standard ATCC 8739. Erst wenn die Messungen in Ordnung sind, werden die Ergebnisse der Probenmessungen angezeigt. Insgesamt können pro Lauf vier dieser Targets gleichzeitig in das Gerät eingebracht und somit in kurzer Zeit 192 Identifizierungsergebnisse von unterschiedlichen Proben erhalten werden.

Die verwendete Matrix ist eine gesättigte Lösung von Alpha-Cyano-4-Hydroxy-Cinnamic-Acid (CHCA). Sie wird auf die mit Probe vorbereiteten Spots pipettiert. Das Gemisch muss trocknen und zeigt dann die typische Kristallbildung der Matrix, die die Probe nun umschließt. Hefen werden vor Zugabe der Matrix direkt auf dem Target mit 25-prozentiger Ameisensäure aufgeschlossen. Für Schimmelpilze schlägt der Hersteller ein geringfügig aufwändigeres Aufschlussverfahren vor.

In der Myla-Software wird die Übereinstimmung der gemessenen Massenspektren zu den in der Vitek-MS-Industrie-Datenbank hinterlegten Spektren in Prozent angegeben und je nach Güte der Identifizierung in drei verschiedene Kategorien eingeteilt. Gute Ergebnisse erhält man mit 99,9- bis 60-prozentiger Übereinstimmung des Spektrums mit nur einem Mikroorganismus.

Besteht eine geringe Selektivität mit einem Konfidenzwert jeweils kleiner als 50 %, bedeutet dies, dass zwei bis vier Keime in Frage kommen und das Ergebnis durch Zusatztest weiter eingegrenzt werden muss. Darunter fallen auch Keimgruppen, die mit der molekularen Methode nicht unterschieden werden können und in der Datenbank zusammengefasst hinterlegt sind, z.B. Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides. Erhält man kein Ergebnis bzw. mehr als vier Vorschläge, so symbolisiert es die Software als keine ID.

Die Maldi-Tof-Methode birgt großes Potenzial bei der Identifizierung von Mikroorganismen und führt auch direkt von Originalproben zu guten Ergebnissen. Bei der Auswertung eines Hygienemonitorings kann schon eine Verdachtsdiagnose gestellt werden, um weitere Maßnahmen besser abzustimmen. Jedoch ist es unerlässlich, parallel einen Reinheitsausstrich auf einem Vollmedium zu machen, da Mischkulturen nicht erkannt werden. Die Ergebnisse dürfen nicht isoliert betrachtet werden. Eine Plausibilitätskontrolle ist und bleibt ein wichtiges Instrument bei der Identifizierung von Mikroorganismen durch automatisierte Verfahren. ●

* Der Autor ist Leiter des Geschäftsfeldes Mikrobiologische Dienstleistungen der Labor L+S AG, Bad Bocklet.

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