SBSE Spurensuche im Bieraroma: Terpenoide analysieren

Hopfen enthält Terpenoide, die Bier einen feinen, bitteren Geschmack und das herbe Aroma verleihen. Weil ihre Konzentration während des Brauvorgangs allerdings schwankt, bedarf es einer kontinuierlichen messtechnischen Kontrolle. Möglichst viele der Komponenten im Bieraroma simultan auch aus kleinen Proben zu detektieren und zu quantifizieren, gelingt der japanischen Brauerei Asahi mittels GC/MS in Verbindung mit der Stir-Bar-Sorptive-Extraction kurz SBSE.

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Die Ingredienzien Hopfen und Malz machen Bier auf natürliche Weise haltbar und verleihen ihm seinen unverwechselbaren Geschmack. Vor allem der Hopfen, besser gesagt die darin enthaltenen Terpenoide, prägen das herbe Bieraroma. Da sich die Konzentration der nur in Spuren im Hopfen enthaltenen Terpenoide während des Bierbrauens unter Hitze verändert, bedarf es einer kontinuierlichen Kontrolle ihrer Konzentration; nur so lässt sich eine gleichbleibende Bierqualität sicherstellen. Um möglichst viele Terpenoide auch aus kleinen Proben simultan detektieren und quantifizieren zu können, setzt die japanische Brauerei Asahi auf die GC/MS in Verbindung mit der Stir-Bar-Sorptive-Extraction (SBSE). Über die Vorzüge der SBSE gegenüber anderen Extraktionstechniken berichten Toru Kishimoto und Kollegen aus dem Forschungs- und Entwicklungslabor des Unternehmens im Journal of Agricultural and Food Chemistry [2005; 53(12); 4701-4707].

Klassische Extraktionstechniken schwächeln

Während Einigkeit darüber besteht, hopfenartige Aromastoffe mittels Gaschromatographie und massenselektiver Detektion (GC/MS) zu bestimmen, gehen die Meinungen auseinander, wie Inhaltsstoffe idealerweise aus der Matrix Bier beziehungsweise einer der Brauvorstufen zu extrahieren seien. Lam et al. [1] ließen zwei Liter Bier über Kieselgur laufen, um Linalool, Geraniol und β-Citronellol als für Citrus- und florale Noten verantwortliche Komponenten zu identifizieren. Steinhaus und Schieberle [2] extrahierten Aromakomponenten direkt aus Hopfenkernen und identifizierten Linalool und Myrcen als potenzielle Duftstoffe. De Keukeleire et al. [3] extrahierten verschiedene Hopfensorten mit superkritischem Kohlendioxid und identifizierenten Myrcen, β-Caryophyllen, α-Humulen und β-Farnesen. Auch klassische Extraktionsmethoden kamen zum Einsatz: Irwin [4] und Goiris et al. [5] griffen auf die Säulenchromatographie zurück, um Bier auf seine Aromakomponenten hin zu analysieren. Sie konnten zeigen, dass die sauerstoffangereicherte Sesquiterpenoid-Fraktion, zu der Eudesmol und Humulen-Epoxide, Humulenol II und andere Verbindungen gehörten, ihren Teil zum würzigen Hopfencharakter beiträgt. Lermusieau et al. [6] wiederum chromatographierten über XAD-2-Harz und identifizierten Linalool und β-Damscenon als aromaaktive Bestandteile. Obgleich jede Vorgehensweise zu Ergebnissen kommt, lassen die Resultate laut Toru Kishimoto zu wünschen übrig: „Die Techniken erfordern rohen Hopfen, große Probenvolumina oder Biere mit reichem Hopfenaroma, um die vom Hopfen herrührenden Terpenoide extrahieren zu können. Für die Analyse und Untersuchung von Bieren mit wenig Hopfenaroma, zu denen etwa japanische Biere zählen, sind empfindlichere Analysenmethoden notwendig. Darüber hinaus erweisen sich konventionelle Extraktionstechniken als arbeitsintensiv und sind deshalb für häufige oder umfassende Analysen ungeeignet“, schreiben die Wissenschaftler.

Als vielversprechende Alternative setzten die Japaner die Stir-Bar-Sorptive-Extraction (SBSE) zur Analyse der Terpenoide ein; zum Nachweis im Bier enthaltener flüchtiger Spurenkomponenten hatte sie sich bereits bewährt [7,8]. Die praktische Umsetzung erfolgt mit dem Gerstel-Twister, einem Rührstäbchen für Magnetrührer, das mit 50 bis 300 µL PDMS beschichtet ist; „Die Methode ist einfach zu handhaben, bis zu 1000-mal empfindlicher als die SPME und leicht zu automatisieren“, schreiben Toru Kishimoto und Kollegen.

Konventionelle Extraktionstechniken und die SBSE im Vergleich

Um vergleichen zu können, ob und inwieweit die SBSE der Aufgabe gewachsen ist, extrahierten Toru Kishimoto und Kollegen Terpenoide aus zwei kommerziell erhältlichen japanischen Bieren mit viel beziehungsweise wenig Aroma zunächst mit Dichlormethan; die Wissenschaftler hatten die Flüssig-Flüssig-Extraktion bereits in früheren Arbeiten angewendet. Die Analyse erfolgte mittels GC/MS; die Mengen der vorhandenen Verbindungen wurden aus dem Flächenverhältnis zu einem internen Standard (β-Damascenon) berechnet. Ergebnis: Mit der konventionellen Dichlormethan-Methode extrahierten die Wissenschaftler der Asahi-Brauerei nur drei Verbindungen und zwar Linalool, Geraniol und β-Eudesmol, was sie auf eine Störung durch Matrixbestandteile wie Proteine, Aminosäuren und Polyphenole zurückführten. Im Gegensatz dazu konnten Toru Kishimoto und Kollegen mit der SBSE eine Vielzahl weiterer Substanzen identifizieren, unter anderem β-Eudesmol, Humulen, Humulenepoxid I, β-Farnesen, Caryophyllen und Geraniol. Das Ergebnis zeige klar, so die Wissenschaftler, dass sich mit der SBSE-Methode Substanzen identifiziert lassen, die mit der konventionellen Dichlormethanextraktion nicht zu detektieren waren.

Verhalten der Terpenoide im Brauprozess

„Die Einfachheit der SBSE-Methode, die nur kleine Probenvolumina und einen geringen Arbeitsaufwand erfordert, erlaubt es uns, das Verhalten der Hopfenterpenoide während des ganzen Prozesses des Würzekochens zu verfolgen“, schildern die Wissenschaftler.

Hopfen enthält in der Regel hohe Konzentrationen Caryophyllen, Humulen und β-Farnesen; während des Kochvorgangs lassen sich aber nur relativ geringe Mengen nachweisen. Toru Kishimoto schreibt das deren schlechter Löslichkeit in der Würze zu; β-Citronellol wurde in den Würzeproben nicht detektiert, da es erst während der Fermentation im Gärtank aus Geraniol gebildet wird. Sie beobachteten, dass die Abnahme der Terpenoide in zwei unterschiedlichen Mustern verlief.

Das erste ermittelten die Wissenschaftler beim Myrcen und Linalool, deren Gehalt während des Kochvorgangs rapide abfiel, was zum Teil auf ihre vergleichsweise niedrigen Siedepunkte (Myrcen 167 °C, Linalool 194 °C) zurückzuführen war, die sich in verschiedener Hinsicht in ihrer chemischen Struktur widerspiegelten. Zum Vergleich: Der Siedepunkt von Humulen liegt bei 266 °C, der von β-Farnesen bei 260 °C. „Der Hopfen sollte erst gegen Ende des Kochvorgangs oder danach der Würze zugefügt werden, um höhere Konzentrationen Myrcen und Linalool zu erhalten“, schlussfolgern Toru Kishimoto und Kollegen.

Das zweite Muster wurde in β-Eudesmol, Humulen, Humulenepoxid I, β-Farnesen, Caryophyllen und Geraniol beobachtet, die sämtlich höhere Siedepunkte haben; die Konzentrationen dieser Komponenten nahmen während des Kochvorgangs langsam und zwar linear ab. „Beide Beobachtungen stützen unsere These, dass der dem Hopfenaroma zugrundeliegende Charakter eines Bieres vom Zeitpunkt abhängt, wann der Hopfen in den Brauprozess gegeben wird“, schreiben Toru Kishimoto und seine Kollegen.

Material und Methode: Zwei Alternativen zur Extraktion von Terpenoiden aus Hopfen

• Probenvorbereitung für die Flüssigextraktion mit Dichlormethan (Methylenchlorid): Eine 350-mL-Bierprobe wurde mit 5 µL cis-3-Hepten-1-ol als internem Standard versetzt und mit 150 mL Dichlormethan für die Dauer von drei Stunden bei Raumtemperatur extrahiert. Die Dichlormethanschicht wurde abgetrennt, mit wasserfreiem Natriumsulfat behandelt (30 Minuten) und der Extrakt bei Unterdruck (750 hPa) im Rotationsverdampfer (40 °C) auf etwa 1 mL reduziert.
• Probenvorbereitung für die Stir-Bar-Sorptive-Extraction (SBSE) mit dem Gerstel-Twister: Die verwendeten Gerstel-Twister hatten eine Länge von 20 mm und waren mit 47 µL Polydimethylsiloxan (PDMS) beschichtet. Vor ihrem Einsatz wurden sie für die Dauer von einer Stunde bei 300 °C unter Helium konditioniert. β-Damascenon wurde der Probe (Bier oder Stammwürze) als interner Standard (0,1 ppb) zugegeben. Eine 30-mL Probe wurde mit vier Volumen destilliertem Wasser verdünnt und der Twister hinzugegeben. Das Vial wurde verschlossen und bei 40 °C für zwei Stunden durchmischt. Anschließend wurde das Rührstäbchen entnommen, mit destilliertem Wasser gespült, einem fusselfreien Tuch trockengetupft und in der Thermal-Desorption-Unit (TDU) von Gerstel, die auf dem Injektor des GC sitzt, automatisiert desorbiert. Vor Aufgabe auf die Kapillarsäule wurden die Komponenten im Kalt-Aufgabe-System (KAS) von Gerstel cryofokussiert, anschließend temperaturprogrammiert verdampft. Die Quantifizierung der verschiedenen Komponenten erfolgte anhand ausgewählter Ionen bei folgenden m/z-Werten: 69 (Geraniol), 80 (α-Humulen), 85 (Humulenol), 93 (Linalool, Myrcen, β-Caryophyllen und β-Farnesen), 123 (β-Citronellol und Humulenepoxid I), 149 (β-Eudesmol), 177 (β-Damascenone, interner Standard) und 190 (β-Damascon).
• GC/MS-Bedingungen für die Flüssigextraktion: Verwendet wurden ein GC 6890 sowie ein MSD 5973 N Quadrupolmassenspektrometer von Agilent Technologies sowie eine DB-Wax Kapillarsäule (60 m length x 0,25 mm i.d., Filmdicke = 0,25 µm; Agilent Technologies). GC: Die gepulste Aufgabe von 1 µL Probe erfolgte splitlos; als Trägergas kam Helium (1 mL/min) zum Einsatz. Eingangstemperatur: 250 °C; Ofentemperaturprogramm: 40 °C /5 min (Heizrate: 3 °C /min) bis 240 °C /20 min. MSD: Detektierter Ionen-Massenbereich: 30 bis 359 (m/z); gemessen wurde im Elektronen-Aufschlagmodus (70 eV). Alle Komponenten wurden auf Basis der Massenspektren und der Retentionszeiten im Vergleich mit authentischen Komponenten identifiziert.
• Bedingungen für die Thermodesorption mit anschließender GC/MS-Analyse: Die im PDMS des Twisters sorbierten Aromakomponenten werden im TDU von Gerstel temperaturprogrammiert freigesetzt (25 °C/0 min (Heizrate: 2,5 °C/min) bis 240 °C/5 min) und im Gerstel-Kaltaufgabe-System KAS bei minus 100 °C (N2-Kühlung) cryofokussiert im Modus splitlos. Mit dem Start des GC/MS-Programms erfolgt die temperaturprogrammierte Aufheizung des KAS (minus 100 °C/0 min (Heizrate: 2 °C/min) bis 240 °C/5 min) und damit die Aufgabe der cryofokussierten Probenkomponenten im Modus splitlos. Die GC/MS-Bedingungen gleichen denen der Flüssigextraktion mit Dichlormethan (s.o.).

Literatur

[1] Lam, K. C.; Foster, R. T.; Deinzer, M. L. Aging of hops and their contribution to beer flavor. J. Agric. Food Chem. 1986, 34, 763-779.

[2] Steinhaus, M.; Schieberle, P. Comparison of the most odor-active compounds in fresh and dried hop cones (Humulus lupulus L. variety spalter select) based on GC-olfactometry and odor dilution techniques. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 1776-1783.

[3] De Keukeleire, D.; David, F.; Haghebaert, K.; Sandra, P. Automated reporting on the quality of hops and hop products. J. Inst. Brew. 1998, 104, 75-82.

[4] Irwin, A. J. Varietal dependence of hop flavour volatiles in lager. J. Inst. Brew. 1989, 95, 185-194.

[5] Goiris, K.; De Ridder, M.; De Rouck, G.; Boeykens, A.; Van Opstaele, F.; Aerts, G.; De Cooman, L.; De Keukeleire, D. The oxygenated sesquiterpenoid fraction of hops in relation to the spicy hop character of beer. J. Inst. Brew. 2002, 108, 86-93.

[6] Lermusieau, G.; Bulens, M.; Collin, S. Use of GC-olfactometry to identify the hop aromatic compounds in beer. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 3867-3874.

[7] David, F.; Sandra, P.; Hoffmann, A.; Harms, D.; Nietzsche, F. Elucidation of the Hoppy Aroma in Beers by Stir Bar and Headspace Sorptive Extraction followed by Thermal Desorption – CGC-MS/PFPD. http://www.gerstel.com/an_2001_04.htm (accessed 30th May 2005), Gerstel Application Notes 4/2001.

[8] Demyttenaere, J. C. R.; Sanchez Martinez, J. I.; Verhe, R.; Sandra, P.; De Kimpe, N. Analysis of volatiles of malt whisky by solid-phase microextraction and stir bar sorptive extraction. J. Chromatogr. 2003, 985, 221-232.

[9] King, A. J.; Dickinson, J. R. Biotransformation of hop aroma terpenoids by ale and lager yeasts. FEMS Yeast Res. 2003, 3, 53-62.

[10] Maylan, M. W.; Howard, P. H. Atom/Fragment contribution method for estimating octanol-water partition coefficients. J. Pharm. Sci. 1995, 84, 83-92.

*G. Deußing, ScienceCommunication, 41464 Neuss

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