Nanopartikel-Enzym-Konjugate für die Entwicklung von Biosensoren

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Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Biover- fahrenstechnik (IGB)

Die Aktivestereinheit der am Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik entwickelten Surfmer-Nanopartikel bietet als Ankergruppe optimale Reaktivität mit empfindlichen Biomolekülen und gewährleistet gleichzeitig maximale Stabilität während Herstellung, Lagerung und Transport. Beispielsweise können so unter physiologischen Bedingungen Stickstoff-Nukleophile wie Proteine mit Surfmer-Nanopartikeln umgesetzt werden. Dass auch redoxaktive Enzyme unter Erhalt ihrer Aktivität an Surfmer-Nanopartikel gekoppelt werden können, zeigen Ergebnisse aktueller Forschungsaktivitäten. Die Enzyme Katalase, Laccase sowie Glucose-Oxidase wurden an eine Reihe verschiedener Surfmer-Partikel immobilisiert und deren Enzymaktivität nach der Kopplung bestimmt. Als Nachweisreaktionen dienen hierbei der Verbrauch (bei Katalase) bzw. die Freisetzung (bei Laccase und Glucose-Oxidase) von Wasserstoffperoxid katalysiert durch die immobilisierten Enzyme und nachgewiesen anhand entsprechender auf das Enzymsystem abgestimmter Fluoreszenzassays (s. Abb. 1). In Abbildung 4 ist beispielhaft die Aktivität von Glucose-Oxidase immobilisiert auf p(MMA-co-AUPDS-3%)-Partikeln gezeigt. Die Enzymaktivität ist doppelt so hoch wie auf den entsprechenden hydrolisierten Partikeln. Letztere wurden durch hydrolytische Spaltung der Aktivesterfunktion in Borat-Puffer erzeugt, um die spezifischen Bindungsstellen zu entfernen. Auf den Surfmer-Nanopartikeln koppelt das Enzym gezielt kovalent durch Reaktion der Stickstoff-Nukleophile der Glucose-Oxidase an der dafür vorgesehenen Aktivestereinheit. Wohingegen auf den hydrolisierten Surfmer-Partikeln das Enzym ausschließlich unspezifisch über physikalische Wechselwirkungen, wie Wasserstoffbrückenbindungen oder Van-der-Waals-Wechselwirkungen bindet.

Untersuchungen der Kopplung der drei Enzyme Katalase, Laccase und Glucose-Oxidase an verschiedenen Surfmer-Nanopartikeln bestätigten den Ansatz, dass unhydrolisierte Partikel-Enzym-Konjugate aus Derivaten mit hohem Surfmeranteil im Reaktionsansatz wesentlich höhere Aktivitäten zeigen als solche, die mit weniger Surfmer relativ zur Co-Monomerkonzentration hergestellt wurden. Betrachtet werden muss hierbei die Ladungsmenge auf der Partikeloberfläche, die die Menge der oberflächengebundenen Surfmermoleküle widerspiegelt. Vergleichbare Derivate mit drei Prozent Surfmer im Partikel erbrachten die besten Ergebnisse. Doch nicht nur der Anteil an Surfmer, sondern auch Spacerlänge, polymerisierbare Gruppe und Art des Co-Monomers haben einen maßgeblichen Einfluss auf die Kopplungseigenschaften der Partikel. In Tabelle 1 ist die systematische Untersuchung verschiedener Partikel mit einem Prozent Surfmeranteil dargestellt. Hierbei zeigen sich eindeutige Trends. Nicht nur die Zahl an oberflächengebundenen Surfmermolekülen sind relevant sondern auch unterschiedliche Oberflächenmorphologien oder -ladungen hervorgerufen durch die Verwendung verschiedener polymerisierbarer Gruppen im Surfmermolekül. Zudem hat sich herausgestellt, dass Surfmer-Nanopartikel co-polymerisiert mit pMMA und längeren Spacereinheiten die besten Kopplungseigenschaften gegenüber den untersuchten Oxidoreductasen aufweisen: eine hohe spezifische Kopplung mit geringem Anteil an unspezifischen Wechselwirkungen.

Zusammenfassung, Ausblick und zukünftige Projekte

Die Surfmer-Technologie bietet eine Möglichkeit sehr einfach und in einem Prozessschritt, Enzyme zu immobilisieren. Der Aufbau der Aktivester-funktionalisierten Nanopartikel erlaubt es zudem, diese Kopplungsstrategie auf eine breite Palette an verschiedenen Biomolekülen anzuwenden und durch Wahl der entsprechenden Surfmereinheit die Kopplungschemie optimal einzustellen. Die derzeitigen Entwicklungsansätze verfolgen das Ziel, die Immobilisierungsverfahren zu optimieren, um die Enzyme nahezu quantitativ an die polymere Matrix anbinden zu können. Zudem arbeiten wir daran, neuartige Surfmerstrukturen zu entwickeln, um z.B. unspezifische Kopplungsphänomene zu minimieren oder gezielt an bestimmten Bindungsstellen der Enzyme anzubinden. Ein Entwicklungsziel, das mit diesen Arbeiten verfolgt wird, ist die Etablierung redox-aktiver Barriereschichten für den Nachweis von Fäulnisgasen in Lebensmitteln zur Herstellung aktiver und intelligenter Verpackungsmaterialien. Hierbei besteht besonderer Bedarf in der Entwicklung bioverträglicher Partikel-Systeme.

Literatur:

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*Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik, 70569 Stuttgart

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