Gaschromatographie

Medikamente auf genotoxische Verunreinigungen untersuchen

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Die Äquilibrierung der statischen Headspace-Extraktion erfolgte im Agitator bei 105 °C für eine Dauer von 15 min, wobei die Probe bei einer Drehzahl von 600 pro min geschüttelt wurde. Die Aufgabe von 1 mL Headspace geschah mit einer gasdichten Spritze im Splitmodus 1:10 bei einer Split/Splitless-Temperatur von 250 °C. Für die Trennung der Analyten wurde eine DB-VRX-Säule (20 m x 0,18 mm ID x 1 µm df) von Agilent Technologies verwendet. Beim Trägergas handelte es sich um Helium, das mit 0,8 mL/min durch das System strömte. Der GC-Ofen wurde von 60 °C (1 min) mit 10 °C/min auf 130 °C aufgeheizt und von diesem Punkt aus mit 30 °C/min auf die Endtemperatur von 250 °C. Die massenselektive Erfassung erfolgte durch Elektronenstoßionisierung im SIM-Modus.

Ergebnisse der MPS-Headspacemethode

Das Resultat der MPS-HS-GC/MS: Das durch die Umsetzung von EMS mit PFPT entstandene Pentafluorphenylethylsulfid (Et-TPFB) eluierte bei 9 min, der deuterierte Standard (Et-TPFB-d5) kurz zuvor (s. Abb. 4). Beide Signale ließen sich mittels der extrahierten Ionenchromatogramme bei m/z 228 bzw. 233 quantifizieren. In ihrem Beitrag schlussfolgern die Wissenschaftler, dass sie mit der von ihnen verwendeten Methode und dem eingesetzten GC/MS-System überaus zufriedenstellende Resultate erzielt haben, sprich: eine exzellente Linearität (R2 = 0,999) und Wiederholbarkeit sowie eine Robustheit, die kinetische Studien hinsichtlich der Bildung von Sulfonaten aus Sulfonsäuren erlaubt. Die Nachweisgrenze (Limit of detection, LOD) von EMS lag bei < 0,5 µg/L, die relative Standardabweichung (RSD) bei 3,5%.

Von ähnlich erfreulichen Resultaten berichten Johanna Ubben, Amy Birch und Fenghe Qiu [2] von Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals in Ridgefield, Connecticut, USA. Ebenso wie ihre europäischen Kollegen setzten die US-Experten beim Nachweis von Methylmethansulfonat (MMS) auf die GC/MS, allerdings bei der Probenvorbereitung nicht auf die statische Headspace-Technik, sondern auf die Flüssig-flüssig-Extraktion, wobei sie die Dual-Head-Variante des Gerstel-MPS (s. Abb. 3) einsetzten und zwar unter Verwendung von zwei Spritzen: zur Handhabung großer Flüssigkeitsmengen (250 µL) für die Dosierung der Reagenzien und für die Probenaufgabe von Mikrolitermengen ins GC/MS-System (10 µL).

Automatisierte Probenaufgabe

Das grundlegende Ziel der Wissenschaftler war es, die relative Reaktivität von Methansulfonsäure (MSA) und Natriummethansulfonat (MSA-Na) in methanolischer Umgebung auf die Bildung von MMS zu untersuchen. Hierzu eignet sich die Flüssig-flüssig-Extraktion (FFE); manuell ein überaus arbeits- und zeitintensives Verfahren, das obendrein nur einen geringen Probendurchsatz erlaubt. Ein weiteres Ziel von Ubben und Kollegen war es daher, die bislang praktizierte manuelle FFE quasi eins zu eins auf den MPS-Laborroboter zu übertragen und damit die Effizienz der Probenvorbereitung nachhaltig zu steigern. Besonders bestach der Aspekt, dass sich die Proben mit dem MPS rühren lassen, was die automatisierte Durchführung von In-situ-Extraktionen erlaubt.

Der MPS füllte 100 µL der Probe in ein Röhrchen mit 500 µL deionisiertem Wasser und 500 µL Methylenchlorid. Es folgte die Extraktion bei 600 Umdrehungen pro Minute für die Dauer von einer Minute. Für die Phasentrennung wurden 20 min veranschlagt; durch stündliche Injektion ins GC/MS-System wurde die MMS-Bildung verfolgt.

Ihre Analyse führten die Wissenschaftler auf einem GC 7890A in Kombination mit einem MSD 5975C, beide von Agilent Technologies, durch. Die Trennung erfolgte auf einer Kapillarsäule von Restek (Rtx-VRX, 30 m x 0,25 mm, 1,4 µm). Als Trägergas diente Helium mit einem konstanten Fluss von 1,0 mL/min. Der GC-Ofen wurde temperaturprogrammiert von 100 °C (1 min) mit 10 °C/min auf 160 °C aufgeheizt. Die Injektion der Probe (1 µL) erfolgte mit einem Splitverhältnis von 10:1, die massenselektive Detektion nach Elektronenstoßionisierung im SIM-Modus, wobei folgende Parameter berücksichtigt wurden für Methylmethansulfonat (MMS): Retentionszeitraum 3,0 - 5,0 min, Target-Ion 80 (m/z), Qualifier-Ion 110 (m/z), Verweilzeit 100 ms. Für Ethylmethansulfonat (EMS): Retentionszeitraum 5,0 - 7,0 min, Target-Ion 109 (m/z), Qualifier-Ion 79, Verweilzeit 100 ms.

MPS-Methode verkürzt die Probenvorbereitungszeit auf ein Viertel

Im Ergebnis fanden die Wissenschaftler heraus, dass sich mehr Methylmethansulfonat bildet, je weiter sich das Verhältnis von MSA/MSA-Na in Richtung Methansulfonsäure verschob: „Die MMS-Bildung beschleunigte sich in der Lösung mit 50% oder mehr MSA“, bringen es Ubben und Kollegen auf den Punkt. Darüber hinaus habe die Automatisierung der Methode auf dem MPS eine unkomplizierte stündliche Datenerfassung ermöglicht. Sie wurde validiert und habe sich als spezifisch und linear erwiesen; die statistischen Daten für Wiederfindung und Wiederholbarkeit überzeugten, und die Lösung war über einen Zeitraum von 24 h stabil. Während die manuelle Methode die Präsenz eines Anwenders erforderte, bot der MPS die Chance, Proben unbeobachtet auch über Nacht zu vermessen. Zusammenfassend, schreiben die Wissenschaftler, habe der MPS die Probenvorbereitung auf ein Viertel der bislang üblichen Zeit reduziert. Sie schließen ihre Arbeit mit einem Verweis auf die Möglichkeit der In-situ-Extraktion: „Dieser neue Prozess macht nicht nur die Forschung effizienter, sondern reduziert auch die Variabilität der Resultate, was wiederum zu einer robusteren Analyse führt.“

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Literatur

[1] Karine Jacq, Ed Delaney, Andrew Teasdale, Steve Eyley, Karen Taylor-Worth, Andrew Lipczynski, Van D. Reif, David P. Elder, Kevin L. Facchine, Simon Golec, Rolf Schult Oestrich, Pat Sandra, Frank David. Development and validation of an automated static headspace gas chromatography–mass spectrometry (SHS-GC–MS) method for monitoring the formation of ethyl methane sulfonate from ethanol and methane sulfonic acid. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 48, Issue 5, 15 December 2008, Pages 1339–1344

[2] Johanna Ubben, Amy Birch, and Fenghe Qiu. ”Use of the Gerstel Multi-Purpose-Sampler (MPS) as a Sample Preparation Tool to Enhance the Efficiency of Mesylate Formation Studies.” Poster-Präsentation.

* G. DEUßING: Redaktionsbüro G. Deußing, 41464 Neuss

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