GC/MS PAK-Analytik in Lebensmitteln mittels GC/MS

Die Gruppe der polyzyklischen, aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK) umfasst etwa 250 verschiedene Substanzen, von denen einige eine krebserzeugende Wirkung besitzen. Aufgrund dieser Eigenschaften ist die PAK-Analytik gerade in der Lebensmittelüberwachung von enormer Wichtigkeit. Forscher haben nun eine neue Methode entwickelt, die auf GC/MS basiert.

Anbieter zum Thema

Shimadzu Deutschland GmbH

PIERALISI Northern Europe B.V. NL Deutschland

Solvias AG

Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG

Polyzyklische Aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind eine Gruppe organischer Verbindungen, die zwei oder mehr kondensierte aromatische Kohlenstoffringe enthalten. Sie werden hauptsächlich bei pyrolytischen Prozessen, insbesondere bei der unvollständigen Verbrennung organischen Materials gebildet. Somit gelangen sie auch in Lebensmittel. Darüber hinaus können Lebensmittel mit PAK aber auch in Folge von technologischen Verfahren wie Trocknen und Räuchern belastet werden.

Die Gruppe der PAK umfasst bis zu 250 verschiedene Substanzen, von denen einige Krebs erzeugende Eigenschaften aufweisen. Die bekannteste karzinogene PAK-Verbindung ist das Benzo-[a]pyren, welches bislang als Leitsubstanz verwendet wird. Daneben wurden vielfach noch die anderen der sog. EPA-PAK bestimmt, die in den 70er-Jahren von der amerikanischen Umweltbehörde (US EPA) als am häufigsten in der Umwelt vorkommenden PAK-Verbindungen identifiziert worden waren. Mittlerweile bestehen Zweifel, ob Benzo-[a]pyren als alleinige Leitsubstanz überhaupt geeignet ist, um die Belastung von Lebensmitteln mit PAK richtig einschätzen zu können. Aus diesem Grund empfiehlt die EU-Kommission [1] den einzelnen EU-Mitgliedsstaaten, die Untersuchung der PAK auf die sogenannten SCF-PAK auszudehnen. Diese Gruppe von PAK wurde vom Wissenschaftlichen Ausschuss Lebensmittel (Scientific Committee on Food, SCF) als karzinogen eingestuft.

Diese neue Liste des SCF unterscheidet sich deutlich von der Liste der EPA-PAK. Einerseits fehlen die leichten PAK mit zwei (Naphthalin) und drei aromatischen Ringen (Acenaphthylen, Acenaphthen, Fluoren, Phenanthren und Anthraccen) und die PAK-Verbindungen Fluoranthen und Pyren, für die bislang keine bzw. nur sehr geringe Hinweise auf kanzerogene Eigenschaften vorliegen. Andererseits kommen die Verbindungen Cyclopenta-[c,d]pyren und 5-Methylchrysen sowie vier Dibenzpyrene (Dibenzo-[a,e]pyren, Dibenzo-[a,h]pyren, Dibenzo-[a,i]pyren und Dibenzo-[a,l]pyren) hinzu, wobei insbesondere das Dibenzo-[a,l]pyren in jüngster Zeit im Fokus des Interesses steht, da toxikologische Untersuchungen darauf hinweisen, dass Dibenzo-[a,l]pyren ein deutlich stärker ausgeprägtes kanzerogenes Potenzial aufweisen könnte als Benzo-[a]pyren [2].

SCF-PAK in Lebensmitteln mit GC/MS analysieren

Im Bereich Rückstandsanalytik der Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel in Kulmbach werden Lebensmittel schon lange auf PAK-Rückstände analysiert. Die eingesetzten Methoden zur Bestimmung der EPA-PAK sind längst etabliert [3]. Nach ersten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass die Probenvorbereitung bestehend aus beschleunigter Lösungsmittelextraktion (ASE), Gelpermeationschromatographie (GPC) und Fraktionierung an einer Minikieselgelsäule auch für die Aufarbeitung der SCF-PAK in Fleischerzeugnissen geeignet ist. Alle SCF-PAK können mit diesem Verfahren aus dem Lebensmittel hinreichend extrahiert werden. Zur homogenisierten Probe werden 50 µl von einem Quantifizierungsstandard gegeben, der fluorierte und isotopenmarkierte PAK enthält. Mithilfe der beschleunigten Lösungsmittelextraktion wird die Probe bei 100 °C und 100 bar in zwei statischen Phasen extrahiert. Als Extraktionsmittel dient n-Hexan. Der im Stickstoffstrom zur Trockene eingeengte ASE-Extrakt wird in Cyclohexan/Ethylacetat (50:50, v/v) gelöst und filtriert. Durch die anschließende GPC werden höhermolekulare Substanzen wie Lipide entfernt. Die GPC-Säule (ID 25 mm) ist gefüllt mit einem Polystyrolgel (Bio-Beads SX3, Füllhöhe 42 cm). Die Flussrate beträgt 5 ml/min mit Cyclohexan/Ethylacetat (50:50 v/v). Das zur Trockene eingeengte GPC-Eluat wird in Cyclohexan gelöst und auf eine konditionierte Kieselgel-Kartusche (1 g/6 ml) überführt, um mithilfe der Festphasenextraktion höherpolare Substanzen zu eliminieren. Das Eluat der Festphasenextraktion wird danach zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in Isooctan gelöst und mit 50 µl eines PAK-Wiederfindungsstandards, der deuterierte PAK-Verbindungen enthält, versetzt. Die Probe wird vorsichtig im Stickstoffstrom auf ein Volumen von etwa 50 µl eingeengt und mittels GC/MS analysiert [4]. Die hierfür erforderlichen gaschromatographischen Trennbedingungen mussten neu erarbeitet werden, um alle relevanten PAK entweder über ihre unterschiedlichen Retentionszeiten oder über ihre unterschiedlichen Massen mit einem GC/Quadrupol-MS zuverlässig quantifizieren zu können.

In der Vergangenheit erwies es sich als besonders schwierig, die Benzofluoranthene zu quantifizieren, da deren gaschromatographische Trennung auf den bislang üblicherweise für die PAK-Analytik eingesetzten unpolaren GC-Phasen basierend auf 5% Phenyl- und 95% Dimethyl-Polysiloxan nicht möglich war. Aus diesem Grund wurden verschiedene Säulen geprüft. Als besonders geeignet für die Trennung der SCF-PAK erwies sich die Varian FactorFour-Säule VF-17ms, eine Kapillarsäule, deren Phasenzusammensetzung 50% Phenyl- und 50% Dimethyl-Polysiloxan entspricht. Mit dieser Säule und einem optimierten Temperaturprogramm konnten nahezu alle SCF-PAK gaschromatographisch getrennt werden, lediglich Indeno-[1,2,3-cd]pyren und Dibenzo-[a,h]anthracen coeluieren, können aber problemlos über ihre unterschiedlichen Massen detektiert werden. Die optimierten Analysenbedingungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Die Varian VF-17ms-Kapillarsäule zeichnet sich neben der guten Selektivität für die Trennung der SCF-PAK durch ein äußerst niedriges Säulenbluten aus, was insbesondere für die empfindliche Bestimmung der spät eluierenden Substanzen wichtig ist. Aus dem Chromatogramm eines nativen Standards (s. Abb. 1), der alle SCF-PAK in einer Konzentration von etwa 50 ng/ml enthielt, konnten die in Tabelle 2 aufgeführten Retentionszeiten ermittelt werden. Die Elutionsreihenfolge der Isomere Chrysen und Benzo-[a]anthracen sowie der Benzofluoranthene wurde durch Injektion der entsprechenden Einzelstandardverbindungen abgesichert.

Auch das vom Joint FAO/WHO Experts Committee on Food Additives (JECFA) [5] als besonders relevant eingeschätzte Benzo-[c]fluoren könnte mit dieser GC/MS-Methode bestimmt werden. Es kann mithilfe der Probenvorbereitung analytisch erfasst werden und eluiert auf der GC-Säule einige Minuten vor dem Benzo-[a]anthracen.

Anwendung der GC/MS-Methode auf geräucherte Fleischerzeugnisse

Die Eignung dieser GC/MS-Methode für geräucherte Fleischerzeugnisse wurde zunächst mit der stark geräucherten Rohwurst Kaminwurzn (s. Abb. 2) überprüft. Die gaschromatographische Trennung der Verbindungen Cyclopenta-[c,d]pyren (CPP), Benzo-[a]anthracen (BaA) und Chrysen (CHR) in Kaminwurzn ist auf einer VF-17ms-Säule im Gegensatz zu einer Säule mit nur 5 Prozent Phenylanteil leicht möglich (s. Abb. 3).

Obwohl CPP (M = 226) ein anderes Molekulargewicht besitzt als BaA und CHR (jeweils M = 228), ist eine gute chromatographische Trennung dennoch für eine zuverlässige Quantifizierung von CPP erforderlich, da BaA und CHR auch Fragmentionen der Masse 226 aufweisen und bei ungenügender gaschromatographischer Trennung eine Quantifizierung von CPP verfälschen würden. Die gaschromatographische Trennung der Benzofluoranthene in der Matrix Kaminwurzn auf einer VF-17ms-Säule ist in Abbildung 4 dargestellt. Es konnte also auch im geräucherten Fleischerzeugnis eine gaschromatographische Basislinientrennung und damit eine zuverlässige Quantifizierung der drei Benzofluoranthene erreicht werden. Auch bei der Quantifizierung der Dibenzpyrene ist die 50 Prozent Phenyl-Phase einer 5 Prozent Phenyl-Phase deutlich vorzuziehen, da auf dieser Phase die Elutionsabstände zwischen den einzelnen Dibenzpyrenen größer sind. Eine größere zeitliche Auftrennung der Dibenzpyrene ist notwendig, um die vier zu bestimmenden Dibenzpyrene von möglichst vielen Isomeren zu trennen (s. Abb. 5). Je mehr Isomere voneinander getrennt werden können, desto kleiner ist der Quantifizierungsfehler bei der Bestimmung der Gehalte.

Fazit: Die von der EU zur Bestimmung in Lebensmitteln empfohlenen sog. SCF-PAK können mit der hier dargestellten Methode in verschiedenen Lebensmitteln quantifiziert werden. Insbesondere bei der Trennung der wichtigen Dibenzpyrene zeigt sich die hervorragende Selektivität der verwendeten 50 % Phenylphase VF-17ms für diese Substanzen. Stationäre Phasen mit 50 Prozent Phenylgehalt sind den häufig für die Analytik der EPA-PAK verwendeten 5 Prozent Phenylphasen eindeutig vorzuziehen.

Literatur

[1] Empfehlung der Kommission vom 4. Februar 2005 über die genauere Ermittlung der Mengen von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in bestimmten Lebensmitteln (2005/108/EG)

[2] Higginbotham, S., Ramakrishna, N., Johansson, S., Rogan, E., Cavalieri, E. (1993): Tumor-initiating activity and carcinogenicity of dibenzo[a,l]pyrene versus 7,12-dimethylbenz[a]anthracene and benzo[a]pyrene at low-doses in mouse skin.Carcinogenesis 14, 875-878

[3] Jira, W. (2004): A GC/MS method for the determination of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in smoked meat products and liquid smokes. Eur Food Res Technol 218, 208-212

[4] Jira, W., Ziegenhals, K., Speer, K., Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in smoked meat products following the new EU standards, Fleischwirtschaft 86 (10), 2006, S. 103-106

[5] Summary and Conclusion of the Joint FAO/WHO Expert Commitee on Food Additives, Sixty-Fourth meeting, Rome, 8-17 February 2005, JCEFA/64/SC

* K. Ziegenhals, W. Jira, Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel, 95326 Kulmbach**K. Speer, Institut für Lebensmittelchemie TU Dresden, 01062 Dresden

(ID:201609)