Ultrazentrifugation Ultrazentrifugation – Einsatzmöglichkeiten und Hindernisse

Autor / Redakteur: Nadia Boujtita* und Stephanie R. Noles** / Marc Platthaus

Eine Ultrazentrifuge kann Kräfte entfalten, die tausend- oder millionenfach höher sind als die Schwerkraft. Außerdem haben sich Ultrazentrifugen in vielen Anwendungsbereichen der wissenschaftlichen Forschung als außerordentlich wertvolle Laborinstrumente bewährt. Lesen Sie hier u.a., welche Kombination von Rotor und Probenröhrchen bei der Ultrazentrifugation die besten Ergebnisse liefern.

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1 Ultrazentrifugen erreichen bis zu 150 000 Umdrehungen pro Minute.
1 Ultrazentrifugen erreichen bis zu 150 000 Umdrehungen pro Minute.
( Archiv: Vogel Business Media )

Ultrazentrifugen sind gerade aus der biologischen Probenvorbereitung nicht mehr wegzudenken. Mit Geschwindigkeiten von bis zu 150 000 Umdrehungen pro Minute (U/min) bei der Partikeltrennung und einer relativen Zentrifugalbeschleunigung (RZB) von über 1 000 000 x g ist die Ultrazentrifugation eine ideale Technik für die Zellbiologie (subzelluläre Fraktionierung), Proteomik (Reinigung und Fraktionierung von Proteinen und Lipoproteinen), Genomik (RNA- und DNA-Reinigung), Mikrobiologie (Pelletierung und Virusreinigung/-konzentration) aber auch in der Nanotechnologie zur Reinigung und Trennung von Nanopartikeln.

Analytisch oder präparativ?

Die Ultrazentrifugation kann sowohl für analytische als auch für präparative Zwecke eingesetzt werden.

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Die analytische Ultrazentrifugation wird in der Regel zur Bestimmung von Sedimentationskoeffizienten und Molekülgewichten eingesetzt. Die Probenbestandteile werden bei dieser Methode nach ihrer Dichte getrennt. Die analytische Ultrazentrifugation liefert Informationen über Form, Konformationsänderung und Größenverteilung von Makromolekülen.

Doch auch größere Probenvolumina können bearbeitet werden: Zu den biologischen Anwendungsgebieten der präparativen Ultrazentrifugation gehört die Pelletierung von Feinpartikelfraktionen wie Zellorganellen und Viren. Darüber hinaus eignen sich präparative Zentrifugen auch für die Gradiententrennung. Zur Trennung von Organellen werden in der Regel Saccharosegradienten, zur Trennung von Nukleinsäuren Cäsiumsalzgradienten verwendet.

Theoretische Grundlagen

Die entscheidenden Faktoren bei der Ultrazentrifugation sind die Größe und Dichte des Ausgangsmaterials. Davon hängt es ab, ob eine differenzielle Zentrifugation oder eine Dichtegradientenzentrifugation angewandt wird.

Die differenzielle Zentrifugation ist eine Methode zur Pelletierung von Partikeln mit abnehmender Sedimentationsgeschwindigkeit, wobei Geschwindkeit und Dauer der Zentrifugation bei jedem Durchlauf gesteigert werden. Bei der Trennung von Zellmaterial setzen sich größere und dichtere Komponenten, beispielsweise der Zellkern oder der Golgi-Apparat, am schnellsten ab und bilden am Boden des Röhrchens ein Pellet. Kleinere Komponenten mit geringerer Dichte, wie mikrosomale Vesikel und Lysosomen, bleiben dagegen in Suspension (Überstand).

Die Dichtegradientenzentrifugation ist eine Methode der Partikeltrennung, die sich die unterschiedlichen Sedimentationsgeschwindigkeiten der Komponenten zunutze macht. Diese kommen auf unterschiedlichen Höhen im Röhrchen zum Stillstand, nachdem sie ein Dichtegleichgewicht mit dem Lösemittel des umgebenden Milieus erreicht haben. Es gibt zwei Arten der Dichtegradientenzentrifugation: Zonenzentrifugation und isopyknische Zentrifugation. Bei der Zonenzentrifugation werden die Partikel nach Molekülgewicht getrennt. Dazu wird die Probe als Überschicht auf eine gebrauchsfertige Lösung mit Gradientenbildner, z.B. Saccharose, aufgebracht. Zum Boden des Röhrchens hin wird die Dichte der Probe immer größer, wobei die Partikel je nach ihrem Sedimentationswert isolierte Banden bilden. Diese Art der Zentrifugation stellt eine effektive Methode zur Trennung von Proteinen, DNA, ribosomalen Untereinheiten oder Polysomen dar.

Die isopyknische Zentrifugation ist eine Gleichgewichtszentrifugation, bei der die Partikel nach Dichte getrennt werden. Vor der Zentrifugation wird die Probe mit einem Gradientenbildner (Cäsiumchlorid, CsCl) vermischt, der bei der Zentrifugation einen Dichtegradienten erzeugt. Die Partikel in der Probe wandern je nach Dichte zum entsprechenden isopyknischen Punkt des Gradientenmaterials. Diese Art der Zentrifugation eignet sich für die Trennung unterschiedlicher DNA-Typen (zirkulär, linear, Doppelstrang, Einzelstrang usw.), für die Trennung von DNA und RNA sowie für die Trennung von Lipoproteinen und Zellorganellen.

Anwendungsanforderungen

Um bei der Ultrazentrifugation möglichst aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, müssen alle verwendeten Materialien wie etwa Röhrchen und Flaschen aufeinander abgestimmt und für die Anwendung geeignet sein. Selbst minimale Unstimmigkeiten zwischen Ausstattung, Zubehör und Verbrauchsmaterialien können die Ergebnisse erheblich beeinträchtigen. Tabelle 1 enthält eine Übersicht über geeignete Röhrchen für unterschiedliche Anwendungen. Die geeignete Röhrchengröße hängt vom Probenvolumen ab. Die Röhrchen müssen so befüllt werden, dass es nicht zu einer Verformung mit potenziellem Probenverlust kommt. Darüber hinaus sind unterschiedliche Röhrchenmodelle erhältlich: Dick- und dünnwandig, offen und abgedichtet. Dickwandige Röhrchen halten hohen g-Kräften stand. Dünnwandige Röhrchen lassen sich leicht durchstechen, was eine rasche Probenentnahme ermöglicht. Abgedichtete Röhrchen werden meist für die Zentrifugation sehr wertvoller Proben eingesetzt, bei denen jedes Verlustrisiko ausgeschlossen werden muss. Darüber hinaus steht eine Vielzahl weiterer Röhrchenmodelle – durchstechbar, schneidbar, autoklavierbar und/oder chemisch resistent – für unterschiedliche Anwendungsanforderungen zur Verfügung. Tabelle 2 enthält eine Übersicht über die Röhrcheneigenschaften.

Je nach Modell sind Röhrchen mit bestimmten Rotormodellen kompatibel. Dünnwandige, offene Röhrchen sind hervorragend für Ausschwingrotoren, dickwandige, offene Röhrchen für Festwinkel- und Ausschwingrotoren geeignet. Dünnwandige abgedichtete Röhrchen lassen sich am besten mit Festwinkel- und Vertikalrotoren einsetzen, Oak-Ridge-Röhrchen sollten nur mit Festwinkelrotoren eingesetzt werden.

Ausschwingrotoren bewirken eine horizontale Drehung der Probe im Verhältnis zur Rotationsachse und eignen sich daher ideal für die Trennung großer Volumen (siehe Abbildung 4a). Bei Festwinkelrotoren dagegen ist die Trennstrecke kleiner. Daher eignen sie sich am besten für die Pelletierung und für die isopyknische Bandierung von DNA (siehe Abbildung 4b). Vertikalrotoren bieten die kürzeste Trennstrecke, die bei der Dichtegradiententrennung überhaupt möglich ist, und erlauben daher einen besonders hohen Durchsatz. Das Sediment haftet bei dieser Methode jedoch an der Röhrchenwand und muss von dort entnommen werden. Dies kann sich als schwierig erweisen.

Bei NVT-Rotoren (Near-Vertical Rotors) sind die Röhrchen in einem fast vertikalen Winkel angeordnet, was sehr kurze Laufzeiten ermöglicht. Bestandteile, die nicht bandieren, können auf den Röhrchenboden pelletieren. Dadurch wird die Probenentnahme erleichtert (siehe Abbildung 4c).

Hohe Effizienz bei der Pelletierung

Effizienz ist in der Forschung grundsätzlich von großer Bedeutung. Daher ist der Klärungsfaktor (k-Faktor), also der Messwert für die relative Effizienz bei der Pelletierung, ein wichtiges Kriterium bei der Auswahl eines Rotors. Je kleiner der k-Faktor, desto höher der Wirkungsgrad des Rotors, desto geringer der Zeitaufwand und desto effizienter das Experimentalprotokoll.

Fazit

Um bei der Ultrazentrifugation möglichst aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, müssen alle verwendeten Materialien aufeinander abgestimmt und für die Anwendung geeignet sein. Durch die Auswahl an geeignetem Zubehör kann jede Trennung genau auf die spezifischen Anforderungen der betreffenden Anwendung und des Experimentalaufbaus zugeschnitten werden. So lässt sich bei den Experimenten eine hohe Messgenauigkeit erzielen.

*Dr. N. Boujtita, Thermo Fisher Scientific, Saint-Herblain/Frankreich und

**Dr. Stephanie R. Noles, Thermo Fisher Scientific, Asheville/USA

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