TOC-Bestimmung TOC in Reinstwässern und in der Reinigungsvalidierung sicher bestimmen

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Reinstwässer sowie Proben aus der Reinigungsvalidierung zu untersuchen, ist die TOC- Bestimmung ein übliches Verfahren – auch im Spurenbereich. Die Technologie ist ebenso geeignet, komplexere Moleküle aufzuschließen und sicher zu messen. TOC als Verfahren ist arzneibuchbeschrieben. Ein Überblick über Oxidationsarten, Bestimmungs- und Probenahmemethoden.

Zur Arzneimittel-Herstellung werden in der pharmazeutischen Industrie unterschiedliche Wasserqualitäten verwendet; die gebräuchlichsten sind Aqua Purificata (AP) und Wasser für Injektionszwecke (WFI). Für beide ist u.a. im Europäischen bzw. Amerikanischen Arzneibuch (EP bzw. USP) ein Grenzwert von 0,5 mg/l für den Gehalt an Total Organic Carbon (TOC) festgelegt. Für die TOC-Messung in diesen Reinstwässern kommen zwei Bestimmungsmethoden zum Einsatz – die Differenz- sowie die Direktmethode.

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Beide Bestimmungsmethoden unterscheiden sich in ihrem Vorgehen zur TIC-Bestimmung. Neben organischen Substanzen liegen in den Wässern auch anorganische Kohlenstoffverbindungen vor – in Form von gelöstem Kohlenstoffdioxid, evtl. Carbonaten und Hydrogencarbonaten. Um diese bei der TOC-Bestimmung nicht mit zu erfassen, muss der TIC (Total Inorganic Carbon) eliminiert oder berücksichtigt werden.

Zeit, Chemie, Temperatur und Mechanik spielen die entscheidende Rolle

Der „Sinnersche Kreis“

Unabhängig von der Art der Probenahme ist eine möglichst hohe Wiederfindung essenziell. Allgemein sind für eine Abreinigung und somit Wiederfindungsrate die vier Faktoren – Zeit, Chemie, Temperatur und Mechanik – entscheidend, gemäß dem „Sinnerschen Kreis“ (Dr. Herbert Sinner – Tensidchemiker, Henkel).

Bezüglich der Temperatur als Parameter stehen aus Arbeitssicherheitsgründen in der Regel nur Probenahme-Medien mit Raumtemperatur oder leicht erwärmten Bedingungen zur Verfügung. Um die Produktionsabläufe nicht allzu lange zu unterbrechen, sollte die Zeit der Probenahme möglichst kurz sein. Durch das Abspülen mit höherem Druck, z.B. aus Sprüh-/Reinigungsdüsen, kann die Mechanik verstärkt werden.

Für den Parameter Chemie ist zu beachten, dass das Probenahme-Medium bei der TOC-Bestimmung grundsätzlich frei von organischem Kohlenstoff sein muss. Daher werden in der Regel Reinstwässer verwendet, wie Aqua Purificata oder Wasser für Injektionszwecke. In speziellen Fällen lassen sich auch anorganische Säuren oder Laugen zugeben. Bei Laugen ist zu beachten, dass die Proben für die TOC-Bestimmung einen sauren pH-Wert benötigen, d.h. es kann zu Salzrückständen auf dem Katalysator kommen.

Vor- und Nachteile der Differenzmethode

Bei der Differenzmethode werden zunächst alle Kohlenstoffkomponenten (organisch, wie anorganisch) vollständig oxidiert. Ein Trägergas transportiert das CO₂ zu einem Detektor, der die entstandene Menge als so genannten TC (Total Carbon) detektiert. In einem zweiten Analysenschritt wird eine Mineralsäure (beispielsweise Salzsäure oder Phosphorsäure) zugefügt, die alle Carbonate und Hydrogencarbonate in CO₂ umwandelt. Dieses wird als TIC erfasst. Die Differenz zwischen TC und TIC (TOC = TC – TIC) entspricht dann dem TOC-Gehalt.

Nachteil dieser Bestimmungsmethode ist die so genannte Fehlerfortpflanzung, denn beide Analysenschritte enthalten eine statistische Unsicherheit, die sich bei der Differenz der beiden Konzentrationen addieren. Gerade wenn die TOC-Konzentration im Gesamten recht gering ist oder die TIC-Konzentration wesentlich höher liegt als die des TOC, ist die Methode zur Quantifizierung ungenau und ungeeignet. Im Allgemeinen sollte der TOC > oder = der TIC-Konzentration sein.

Exakter und schneller mit der Direktmethode

Bei einem anderen Verhältnis kommt die Direktmethode zum Einsatz. Zur Probenvorbereitung wird die Probe angesäuert, um die TIC-Komponenten (Carbonate und Hydrogencarbonate) zu CO₂ umzusetzen. Anschließend wird das CO₂ mittels eines Gases aus der Probe gespült. Im Nachgang werden alle vorhandenen Kohlenstoffkomponenten oxidativ zu CO₂ umgewandelt und als so genannter NPOC (Non Purgeable Organic Carbon = nicht ausblasbarer organischer Kohlenstoff) erfasst. Der Vorteil: Die Methode ist exakter und schneller. Sollte die Probe beim Ausgasen allerdings zur Schaumbildung neigen, können hierdurch Unterbefunde ermittelt werden. Daher kommen je nach Probenbeschaffenheit beide Analysenverfahren zur Anwendung.

Zur Oxidation der Kohlenstoffkomponenten haben sich zwei Verfahren durchgesetzt:

• die nass-chemische Oxidation, bei der die Probe in Anwesenheit von Persulfat-Ionen mit UV-Licht bestrahlt wird. Hierbei werden OH-Radikale freigesetzt, die die Kohlenstoffkomponenten zu CO₂ umsetzen.

• die katalytische Verbrennungsoxidation, bei der die Probe auf einen heißen platinbeschichteten Katalysator injiziert wird.

Nachweisgrenzen der zwei Oxidationsarten

Shimadzu bietet beide Oxidationsverfahren in ihren TOC-V und TOC-L Serien an. Die TOC-V Systeme arbeiten mit der nass-chemischen Oxidation. Der Vorteil liegt hier in dem großen möglichen Injektionsvolumen von 20,4 ml, die zur Oxidation in einen Reaktor gebracht werden. Hiermit lassen sich geringste Nachweisgrenzen von <0,5 µg/l erfassen.

Die TOC-L Systeme arbeiten mit der katalytischen Verbrennungs­oxidation. Hierbei wird ein Platinkatalysator bei einer Temperatur von 680 °C verwendet. Diese Oxidation ist wesentlich kraftvoller, vor allem wenn es um die von Partikeln geht. Das maximale Injektionsvolumen bei der katalytischen Verbrennungsoxidation ist durch den thermischen Druckstoß geringer als bei der nass-chemischen Oxidation, jedoch sind auch hiermit Nachweisgrenzen von bis zu 4 µg/l möglich.

Die EP und die USP schreiben keine Oxidationsart vor – beide sind dort einsetzbar. Dafür geben die Arzneibücher Hinweise auf die eingesetzten TOC-Geräte: Sie müssen den TIC eliminieren oder erfassen können (Anwendbarkeit von Differenz- oder Direktmethode) und eine Nachweisgrenze von mindestens 50 µg/l haben. Zudem müssen sie sich einem Systemeignungstest unterziehen, bei dem die Oxidierbarkeit von schwer-oxidierbaren Substanzen (in diesem Fall Benzochinon) sowie von leicht-oxidierbaren Substanzen (in diesem Fall Saccharose) belegt wird.

Diese Verfahren werden aber nicht nur eingesetzt, um die Reinheit von Reinstwässern oder Wässern für Injektionszwecke zu erfassen. Auch in der Reinigungsvalidierung wird die TOC-Analytik eingesetzt.

Reinigungsvalidierung – rechtliche Bestimmungen

Basis für die Durchführung einer Reinigungsvalidierung sind die Vorgaben aus dem EU-GMP-Leitfaden Annex 15 und der Arzneimittel- und Wirkstoffherstellungsverordnung (AMWHV). Im § 6 AMWHV (1) ist festgelegt, dass die Effektivität der eingesetzten Reinigungs-, Desinfektions- bzw. Sterilisationsverfahren zu überprüfen und die entsprechenden Verfahren zu validieren sind. Die Abschnitte 10.6 und 10.7 des EU-GMP-Leitfadens Annex 15 weisen darauf hin, dass Anlagen und Apparate im Rahmen der Reinigungsvalidierung auf Produkt- und Reinigungsmittelrückstände sowie Kontaminationen durch Mikroorganismen und Endotoxine hin geprüft werden müssen.

Für die Prüfung auf Produkt- bzw. Reinigungsmittelrückstände ist die TOC-Bestimmung ein adäquates, und auch im Annex 15 in Punkt 10.6.2 erwähntes, Analyseverfahren.

Die TOC-Bestimmung zeigt hierbei u.a. folgende Vorteile:

• schnelles, rationelles Verfahren,

• im Arzneibuch beschrieben Ph. Eur. 2.2.44/USP <643>,

• im Annex 15 erwähnte Analysenmethode,

• spezifisch für organische Verbindungen,

• geeignet für den Spurenbereich,

• kostengünstig,

• einfache Probenahme mit einem wässrigen Medium wie Aqua Purificata (AP) oder Wasser für Injektionszwecke (WFI),

• hoher Sicherheitsfaktor durch die Worst-Case-Umrechnung.

Probenahme in der Reinigungsvalidierung

Gemäß den Vorgaben des EU-GMP-Leitfaden Annex 15 im Punkt 10.12 sollte die Probenahme im Rahmen der Reinigungsvalidierung durch Wischen (swab) oder Spülen (rinse) erfolgen. Rinse-Beprobungen sind dabei besonders beliebt, da sie sich relativ schnell und kostengünstig durchführen lassen. Dabei wird zwischen der Final Rinse und der Post-Final ­Rinse unterschieden.

Bei der Final-Rinse-Probe wird das letzte Spülwasser bei der Reinigung untersucht. Die hier gemessenen TOC-Werte repräsentieren jedoch nicht die Rückstände auf der Anlage nach der Reinigung, da das letzte Spülwasser bereits abgereinigte Rückstände enthält und über den Abfall entsorgt wird. Bei der Post-Final-Rinse-Probe hingegen werden verbliebene Rückstände durch eine extra Beprobung nach der Reinigung ermittelt. Um schwierige Stellen gezielt zu untersuchen, z.B. Anschlüsse oder Ecken, kann eine Swab-Beprobung die Rinse-Beprobung ergänzen.

Für die Rinse-Probenahme gibt es mehrere gängige Optionen. Die häufigste betrifft CIP-Anlagen (Cleaning in Place). Dabei wird die Anlage mit einer definierten Menge des Mediums befüllt, das durch die Pumpen und Sprühdüsen zu den Oberflächen gebracht wird. Der Strahl aus den Sprüh-/Reinigungsdüsen sorgt dabei für den Mechanikanteil. Der große Vorteil dieser Option ist die Reproduzierbarkeit durch die maschinelle Steuerung. Eine weitere Möglichkeit für geschlossene Behälter, wie ein Müller-Fass, ist es, diese mit einem ausreichenden Volumen zu befüllen, zu verschließen und dann für eine definierte Zeit (z.B. drei bis fünf Minuten) auf einem Taumelmischer zu drehen.

Wenn eine mechanische Unterstützung nicht möglich ist, beispielsweise bei älteren Solida-Mischern oder weil die Anlage zur Beprobung zerlegt werden muss, wird üblicherweise die Rinse-Probenahme durch Abspülen der Oberflächen durchgeführt. Dazu kann das Medium mittels Spritzflasche, Einwegspritze, Becher oder Ähnliches aufgebracht werden. Einen speziellen Fall stellen Schläuche dar. Hier würde für ein komplettes Durchspülen der inneren Oberfläche oftmals ein zu großes Volumen benötigt. Daher erfolgt die Rinse-Beprobung durch „Wippen“. Unabhängig von der Rinse-Technik ist es immer sinnvoll, einen Blindwert des Probenahme-Mediums mit zu untersuchen.

Ist der TOC einer Probe gemäß einer zuvor validierten Methode bestimmt, erfolgt die Berechnung der Rückstandsmenge. Dafür ist es wichtig, das Volumen des eingesetzten Rinse-Mediums zu kennen bzw. zu bestimmen. Im Rahmen der Worst-Case-Umrechnung der gemessenen TOC-Werte auf den gesuchten Kontaminanten wird davon ausgegangen, dass der gesamte gemessene Kohlenstoff von diesem Kontaminanten stammt. Diese Berechnung hat den Vorteil, dass sie bei möglicherweise vorliegenden Spuren weiterer kohlenstoffhaltiger Verbindungen zu höheren ermittelten Kontaminationen der Zielsubstanz führt und damit einen Sicherheitsfaktor darstellt.

Bei der Wasseruntersuchung auf Nummer sicher gehen

Die TOC-Bestimmung ist ein übliches Verfahren für die Untersuchung von Reinstwässern sowie für die Rückstandsprüfung insbesondere von Reinigungsmitteln im Spurenbereich. Die Untersuchung auf TOC ist in den Arzneibüchern monographiert und explizit im EU-GMP-Leitfaden Annex 15 für die Reinigungsvalidierung genannt, z.B. an Rinse-Proben. Durch die TOC-Bestimmung mittels Verbrennungsmethode auf Shimadzu TOC-LCPH-Geräten lassen sich auch komplexere Moleküle aufschließen und sicher bestimmen.

Unabhängig von der Messmethode ist die TOC-Bestimmung inklusive der Probenahmemethoden Swab oder Rinse substanzspezifisch zu validieren. Als Basis dient hierbei in der Regel die ICH Q2(R1) (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), November 2005).

* * A. Bayerl ist Bereichsleiter Reinigungsvalidie- rung und Hygiene, bei Techpharm GmbH in Bruchsal, S. Hupach ist Produktspezialist TOC, Shimadzu Deutschland GmbH in Duisburg. Kontakt: info@techpharm.de; info@shimadzu.de

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