Reinstwasser Flaschenhals Reinstwasser – HPLC-Interferenzen minimieren

Ob Massenspektrometrie, Gaschromatographie oder HPLC – kaum eine Analysemethode kommt ohne Wasser aus. Wie die Wasserreinheit die HPLC beeinflusst, wo die Ursprünge von organischen Verunreinigungen im Wasser liegen und welche Technologien mit welcher Wirksamkeit eingesetzt werden können, um diese zu entfernen, lesen Sie in diesem Artikel.

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Wasser ist der am häufigsten verwendete Reagenzstoff im Analyselabor. Es wird täglich für die Produktion von Puffern, Laborreagenzien, Kalibrierungsstandards, Instrumentenrohlingen, Kulturmedien und Probenlösungen eingesetzt. Insbesondere die Nutzung von hochreinem Wasser ist für jede wissenschaftliche Anwendung, sowohl im akademischen und pharmazeutischen Bereich als auch in der Kosmetik- und Lebensmittelbranche unverzichtbar. Reinstwasser kann als Wasser definiert werden, das keine Stoffe enthält, die Labormethoden, Reagenzien oder Standards potenziell beeinträchtigen. Aufgrund der großen Mengen an Wasser, die bei zahlreichen Versuchsmethoden verwendet werden, einschließlich der Probenvorbereitung, der Flüssigkeits- und der Gaschromatographie sowie der Massenspektrometrie, spielt die Verfügbarkeit von Reinstwasser eine entscheidende Rolle.

Auswirkung von Verunreinigungen auf die HPLC

Die Detektionsgrenzen moderner Labor-instrumente, wie z.B. der induktiv gekoppelten Plasmaspektrometrie/Massenspektrometrie (ICP/MS), der Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS), der HPLC sowie von Fluoreszenzanwendungen, liegen im ppt-Bereich (parts per trillion) oder darunter. Bei diesen Werten ist das Risiko einer Interferenz besonders hoch. Das Auftreten organischer Spurenverbindungen im Reinwasser stellt in vielen Laboren zunehmend ein Problem dar. Es kann sich auf die Auflösung und die Integration auswirken, zu Ghost-Peaks führen, die stationäre Phasenselektivität ändern und sich auf Grundlinien auswirken. Die Umkehrphasen-HPLC wird in Analyselaboren zur Identifizierung und Quantifizierung organischer Verbindungen eingesetzt. Es ist also zwingend erforderlich, dass organische Kontaminanten hier auf ein Minimum reduziert bzw. eliminiert werden, damit Forscher präzise Versuchsergebnisse erzielen können.

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Darüber hinaus kommen auch nicht-organische Kontaminanten vor, die indirekt mit Versuchen interferieren können und genauso bedenklich sind. Wasserverunreinigungen wie anorganische Ionen, Partikel oder gelöste Gase, zum Beispiel, reagieren während der Probenvorbehandlung mit den Reagenzien oder den Analyten und kontaminieren Säulen oder Detektoren bzw. beeinträchtigen die Lebensdauer der Standards. Für exakte und reproduzierbare Testergebnisse bei der analytischen Datenerfassung ist die Verwendung von Reinstwasser also essenziell. Die Ultratrace-HPLC stellt diesbezüglich eine der anspruchvollsten Reinstwasser-Laboranwendungen dar.

Sicherung der Technologie für eine Reinstwasserversorgung

Die Eliminierung organischer Kontaminanten beginnt mit der Wahl des Laborwassersystems. Ein Reinstwassersystem, das auch Typ-I-System genannt wird, sollte aus Materialien bestehen, die einem Auslaugen organischer Verunreinigungen in das Wasser standhalten. Das Gehäuse ist im Idealfall aus einem natürlichen Homopolymer (z.B. Polypropylen) ohne Füllstoff, Weichmacher oder Formentrennmittel angefertigt. Die Aufreinigungsmedien und Harze müssen eine Qualität in Halbleiterklasse aufweisen. Passend ausgelegte Adsorptions- und UV-Oxidationstechniken sind in die Konstruktion der Einheit integriert, damit Wasser frei von organischen Verbindungen geliefert wird.

Identifizierung von Quellen für mobile Phaseninterferenzen

Im folgenden werden verschiedene Wasserquellen miteinander verglichen und Interferenzmaterial anhand der HPLC-Analyse identifiziert. Darüber hinaus werden mobile Phaseninterferenzen und die Eliminierung von Ghost-Peaks, die die Chromatographieergebnisse beeinträchtigen können, in einem Vergleich von HPLC-Flaschenwasser und dem Wasser, das von den Thermo-Scientific-Barnstead-Nanopure-UV- und Easypure-Reinstwassersystemen geliefert wurde, besprochen.

Mobile Phasengrundlinien-Interferenzen stellen in der Regel bei höheren Wellenlängen von 254 nm oder mehr kein Problem dar. Die meisten störenden organischen Substanzen, die in Reinwasser gefunden werden, werden vom Detektor bei diesen Wellenlängen nicht erkannt. Interferenzen oder Ghost-Peaks können jedoch bei niedrigen Wellenlängen wie 210 nm Probleme verursachen. Mehrere Wassersysteme wurden ausgewertet und ein direkter HPLC-Vergleich mit unterschiedlichen Wasserquellen, einschließlich Flaschenwasser (HPLC), gezogen. Abbildung 2 zeigt einen chromatographischen Vergleich von Barnstead-Nanopure-UV-Umkehrphasen-Gradienten mit HPLC-Flaschenwasser und herkömmlichem deionisiertem Wasser. Sowohl das Barnstead-Nanopure-UV- als auch das Easypure-UV-Wassersystem liefert Grundlinien, die keine Ghost-Peaks enthalten, die möglicherweise die Chromatogramme beeinträchtigen können.

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Plastikfilter stellen unter Umständen eine Quelle organischer Kontaminanten dar. Deshalb wurde der 0,2 µm-Endfilter untersucht. Die Herausforderung besteht darin, eine Endfiltration zu realisieren, ohne dass Kontaminanten von Filtrationspartikeln, Benetzungsmitteln und Blasenpunkt-Chemikalien eingeschleppt werden. Die Menge an Wasser, die für die Spülung eines Filters – sowohl eines neuen als auch vor jeder Verwendung – erforderlich ist, muss bewertet und verglichen werden. Die Abbildungen 3 und 4 zeigen die Grundlinien eines Barnstead-Nanopure-UV-Reagenzwassersystems, das den Thermo-Scientific-Hohlfaserfilter und einen vergleichbaren Filter einsetzt, der in einem anderen Reagenzwassersystem verwendet wird. Abbildung 3 zeigt den Vergleich der ersten Proben ohne vorheriges Spülen (nur Initialspülung). Dabei treten an beiden Filtern störende Spitzenwerte auf. Abbildung 4 zeigt die Grundlinien nach einem anfänglichen Spülen mit acht Litern Wasser. Der Hohlfaserfilter ließ sich gut auf eine flache Grundlinie spülen. Der andere Filter hingegen weist immer noch deutliche Spitzenwerte auf. Diese konnten auch nach dem Spülen mit 16 Litern Wasser nicht eliminiert werden.

Spitzenwerte in einem Chromatogramm lassen sich nicht nur auf eine Kontamination über das Wassersystem oder über andere mobile Phasenlösungsmittel zurückführen. Auch organische Lösungsmittel in der Laborumgebung können eine Kontamination über die Luft verursachen. Abbildung 5 zeigt das Ergebnis einer Wasserprobe, die neben dem Chromatographen weniger als eine Minute lang Toluol ausgesetzt war. Das Risiko einer Kontamination aus der Laborumgebung lässt sich minimieren, indem ein Wasseraufreinigungssystem an der Verwendungsstelle eingesetzt wird – das Wasser also nicht erst gelagert wird.

Überlegungen zur Kontaminationskontrolle

Zur Durchführung einer HPLC-Analyse müssen auch andere Faktoren berücksichtigt werden. Dazu gehört das Brennen von Glasgefäßen zur Entfernung organischer Kontaminanten, die sich unter Umständen nach der Reinigung an das Glas angeheftet haben. Auch das korrekte Vorspülen eines Systems muss beachtet werden. Mindestens das erste Chromatogramm des Tages sollte verworfen werden. Auch die Qualität der mobilen Phasenlösungsmittel ist äußerst wichtig. Denn wenn das Lösungsmittel nicht rein genug ist, sind Interferenzen wahrscheinlich. Die Ergebnisse der durchgeführten Tests zeigen, dass das Hohlfaser-Filtrationsmaterial, das in den Barnstead-Nanopure-UV- und den Easypure-UV-Wasseraufreinigungssystemen eingesetzt wurde, störende Substanzen sehr viel schneller ausspülen konnte, als vergleichbares Filtermaterial eines anderen Herstellers. Dies ist auf die natürlich hydrophile Art des Filtrationsmaterials sowie auf das für das Filtergehäuse verwendete Material zurückzuführen. Der Aufwand und der Wasserbedarf, der für das Spülen bis zum Erhalt einer stabilen Grundlinie erforderlich war, hielt sich dabei in Grenzen.

*J. Akana, Ph.D., Associate Product Manager, Thermo Fisher Scientific, Asheville/USA

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