NIR-Nahinfrarotspektroskopie Bioprozesse mit NIR-Nahinfrarotspektroskopie in Echtzeit überwachen

Autor / Redakteur: Dr. Christian Grimm, Dr. Roland Bienert / Anke Geipel-Kern

Eine große Zahl neu zugelassener Medikamente wird heute bereits biotechnologisch hergestellt. In Verbindung mit der Chemometrie liefert die Nahinfrarotspektroskopie Echtzeit-Informationen aus dem Fermenter, die zur Prozessoptimierung genutzt werden können.

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(Bild: Sartorius / Peter Ginter)

In der „roten Biotechnologie“, wie die medizinische Biotechnologie zur Wirkstoffherstellung auch genannt wird, werden mittels gentechnisch veränderter Organismen drei wesentliche Zielproduktgruppen hergestellt: monoklonare Antikörper, therapeutische Proteine und Impfstoffe.

Dabei lassen sich einfachere Wirkstoffe durch modifizierte prokariotische Zellen, wie Bakterien o.Ä., generieren. Zur Herstellung komplexer Proteinstrukturen, wie Antikörper, benötigt man modifizierte Säugetierzellen. Deshalb unterscheidet man biotechnologische Prozesse nach Art der biotechnologischen Organismen grob in Mikroorganismen basierte Fermentationen (MO) und tierische Zellkulturen (CC). Die Art der Prozesse und damit die Anforderungen an Prozessequipment und -führung unterscheiden sich dabei drastisch.

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MO-Prozesse, wie z.B. die Fermentation genetisch veränderter Bakterien, wie E.Coli oder Bacillus, sind aufgrund der Teilungs- und Stoffwechselraten mit Batchzeiten von wenigen Tagen sehr schnell. Das Fermentationsmedium ist meist komplex und enthält Varianten von Primär- und Sekundärzuckern als Kohlenstoffquelle. Zudem dienen z.B. Hefeextrakte oder Pepton als Stickstoffquelle. Aufgrund der hohen Stoffwechselrate werden solche Systeme stark gerührt und mit viel Sauerstoff versorgt.

Bei CC-Prozessen geht es etwas gemütlicher zu Werke. Tierische Zellkulturen haben Prozesszeiten von mehreren Tagen bis einigen Wochen. Als Medien werden komplett chemisch definierte Ansätze verwendet. Basierend auf einem pH-Puffer sind speziell für den verwendeten Organismus abgestimmte Spurenelemente, Vitamine und Aminosäuren zugesetzt. Als Nahrungsquellen werden Glucose und Glutamin verwendet. Die Agitation ist sehr viel moderater, da die Organismen meistens schon wegen ihrer Größe und ihrer Zellmembran sehr anfällig gegen Scherstress sind.

Alleskönner gesucht – simultane Multiparameteranalytik

Die NIR-Spektroskopie ist bekannt für eine verlässliche quantitative Bestimmung mehrerer Parameter. Auch bei Fermentationsprozessen können verschiedene Parameter gleichzeitig erfasst werden, wobei die besondere Stärke in der Vorhersage von Zellparametern liegt, da diese Information aus dem Anteil des Streulichtes gewonnen wird. So ist z.B. die Bestimmung der Gesamtzellzahl in der Kultivierung von tierischen Zellen sehr gut möglich. Dabei kann mithilfe der statistischen Modellbildung sogar eine genauere Vorhersage erzielt werden als es mit typischer Laboranalytik möglich wäre.

Dies liegt an der Labormethodik der Zellzählung selbst sowie Schwankungen, die durch die Probennahme und -vorbereitung verursacht werden. Auch die Viabilität, also der Anteil der lebenden Zellen an der Gesamtzellzahl kann mithilfe der NIR-Spektroskopie auf wenige Prozent genau erfasst werden. Dies ist besonders für die Bestimmung des Abbruchzeitpunktes einer Kultivierung von großem Interesse, da mit abnehmender Viabilität die Aufreinigung des Produktes zunehmend erschwert wird.

Neben den Zellparametern können auch einzelne Nährstoffe wie Glukose bestimmt werden, sofern sie in ausreichender Konzentration – einige Gramm pro Liter – vorliegen. Die Genauigkeit der Vorhersagen kann dabei nicht mit den exzellenten Labormethoden mithalten, gibt aber im Gegenzug ein Echtzeitprofil, das vor allem in Hinblick auf Feed-Strategien von enormen Nutzen sein kann.

Auch wenn eine Zufütterungskontrolle auf alleiniger Basis der NIR-Spektroskopie noch aussteht, so scheint es dennoch ein gangbarer Weg zu sein. Das ist besonders in bakteriellen Fermentationen von großem Interesse, weil die Ergebnisse der Laboranalytik nur mit erheblicher Zeitverzögerung zur Verfügung stehen, was für diese hoch dynamischen Prozesse häufig zu spät ist. Die Online-Vorhersage mittels NIR-Spektroskopie kann somit Informationen liefern, die für die Optimierung der Prozesssteuerung von großem Nutzen sein können.

NIR-Spektren qualitativ oder quantitativ auswerten

Die Nahinfrarotspektroskopie (NIR) verwendet Anregungslicht im Bereich von etwa 900-2500 nm. In diesem Bereich absorbieren Obertöne und Kombinationsschwingungen der meisten organischen chemischen Bindungen (z.B. OH, CH, NH usw.). Dabei ist die Absorption der funktionellen Gruppen abhängig von ihrer chemischen Umgebung.

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Aufgrund der Vielzahl sowie der ähnlichen Anregungsenergien der Kombinations- und Oberschwingungen kommt es zu einer Überlagerung der Absorptionsbanden. Die resultierenden breiten Banden in einem NIR-Spektrum enthalten daher die Informationen mehrerer Bindungsarten, weshalb meist problemlos eine direkte Bandenzuordnung möglich ist. Daher sind mathematisch statistische Verfahren zur Auswertung der Spektren nötig, die als Chemometrie bezeichnet werden.

Die Auswertung der NIR-Spektren kann qualitativ oder quantitativ erfolgen. Für eine qualitative Auswertung werden keinerlei Kalibrierungen und somit auch keine Referenzmessungen benötigt. Das Spektrum wird wie bei einer Mustererkennung miteinander verglichen, wodurch beispielsweise die Identität eines Materials sowie der gewünschte Endpunkt auf gleiche Weise bestimmt werden können.

Eine gängige Methode ist die Darstellung des Prozessverhaltens als Trajektorien (Batch Evolution Model, BEM). Die Hauptvarianzen innerhalb der Spektren, ausgedrückt durch die Hauptkomponenten einer PCA (principal component analysis), werden dabei als Trajektorien über die Zeit dargestellt. Dadurch haben die Prozessführer den Verlauf jederzeit im Blick und können auf unerwünschte Änderungen sofort reagieren (vgl. Abbildung oben).

Voraussetzung für jedes Prozessgerät ist ein hohes Maß an Robustheit des Sensorsystems unter Prozessbedingungen. Moderne NIR-Prozessspektrometer werden daher ohne bewegliche Teile konzipiert und arbeiten mit redundanten Lichtquellen, um über viele Jahre dauerhaft und wartungsfrei zu laufen.

Der Aufbau jedes spektroskopischen Messsystems ist prinzipiell vergleichbar. Hauptbestandteile sind die Strahlungsquelle und eine Detektion des Lichtes nach der Wechselwirkung mit der Probe, wobei dieses auf verschiedene Art nach Wellenlängen separiert wird. State-of-the-art NIR-Spektrometer für den Prozess arbeiten mit Gittern als dispersives Element, wobei die Detektion oft mit einem Photodiodenarray erfolgt.

Der große Vorteil besteht bei dieser Anordnung in der simultanen Erfassung des gesamten Spektralbereichs. Dadurch ist auch bei im Prozess üblichen Probenströmen gewährleistet, dass das gesamte Spektrum der Messung derselben Probe entstammt. Insbesondere bei sehr dynamischen Systemen, in denen sich streuende Partikel, wie z.B. Zellen oder Luftbläschen befinden, wie sie typischerweise in Fermentationsprozessen zu finden sind, haben Diodenarraysysteme deutliche Vorteile gegenüber anderen Spektrometertypen.

Besonderheiten und Lösungen für Fermentationsprozesse

Das Know-how besteht bei modernen NIR-Systemen nicht nur aus der Hard-, sondern auch aus der Software zur Datenverarbeitung und -interpretation.

Bei der quantitativen Auswertung verhindert die Komplexität der Bandenüberlagerungen eine direkte Quantifizierung z.B. durch die Auswertung der Flächen oder Intensitäten einer Bande. Man bedient sich daher verschiedener statistischer Verfahren, um die für die Quantifizierung essenziellen Bestandteile im NIR-Spektrum herauszufiltern. Diese statistischen Verfahren werden unter dem Oberbegriff „Chemometrie“ zusammengefasst. Häufig eingesetzt wird beispielsweise die Hauptkomponentenanalyse – Principal Component Analysis, PCA – oder das Partial-Least-Square-Verfahren, PLS.

Bei einigen dieser Verfahren werden die funktionalen Zusammenhänge zwischen den Spektren und dem zu messenden Parameter, z.B. Glukosekonzentration, ermittelt. Dabei werden meist mehrere Variablen – Bereiche im Spektrum – für die Auswertung herangezogen, weswegen man auch von multivariater Datenauswertung spricht. Für Fermentationsprozesse ist es besonders schwierig, robuste chemometrische Modelle zu entwickeln, da hier zum einen Zielparameter stark korrelieren und zum anderen Variationen von einem Batch zum anderem zu berücksichtigen sind.

Diese Hürden – einmal identifiziert – lassen sich überwinden, indem das Kalibrationsmodell auf eine solide Datenbasis gestellt wird. Dafür sollten während eines Batches zwischen zehn und 20 Proben genommen, sodass die Variationen während des Prozesses ausreichend abgebildet werden. Außerdem ist es entscheidend, eine gewisse Anzahl von Batches zu vermessen, sodass auch Variationen, die von einem Lauf zum nächsten auftreten, in das Modell Eingang finden. Dabei müssen die Daten für die Kalibrierung und für die Validierung der chemometrischen Modelle aus unterschiedlichen Batches stammen.

Dadurch wird in der Validierung der Ernstfall geprobt und ein komplett neuer Batch vorhergesagt, der nicht schon wie bei der Kreuzvalidierung im Kalibrierset enthalten ist. Erfahrungsgemäß sind die Modelle bereits nach drei bis vier Läufen so robust, dass sie in den folgenden Prozessen mehrere Zielparameter in Echtzeit und mit guter Präzision vorhersagen. Das Auflösen von Korrelationen zwischen verschiedenen Zielparametern, z.B. Glucoseverbrauch und Biomasseaufbau, gelingt in den meisten Fällen nur experimentell.

Dafür eignen sich besonders Spiking-Experimente, bei denen ein Analyt in ausreichender Menge etwa am Ende einer Fermentation hinzugegeben wird. Proben, die nach dem Spiking entnommen wurden, zeigen dann keinerlei Korrelation mehr zu anderen Analyten, sodass nur solche Änderungen in den Spektren ins Modell eingehen, die tatsächlich von den Konzentrationsänderungen des Zielanalyten hervorgerufen wurden. ●

* Dr. C. Grimm ist Manager R&D PAT bei Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen; Dr. R. Bienert ist Mitarbeiter bei Novartis in Basel/Schweiz.

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