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Fluoreszenzspektroskopie

Online-Prozesskontrolle mittels 2D-Fluoreszenzspektroskopie

14.08.2007 | Autor / Redakteur: Dipl. Ing. (FH) Tobias Merz, ?Prof. Dr. Rudolf Kessler / Anke Geipel-Kern

Aufbau des Online-2D-Fluoreszenzspektrometers und die verwendeten Komponenten: Xenonlampe: XBO 75W Monochromator: Spex 1681, 0,22 m, Gitter: 600 l/mm Pushbroom Imagers: ImSpector V8, Specim, 80 µm Schlitz, 380 nm bis 750 nm, Kamera: PCO, PixelFly Scientific, 2/3“ CCD, 1280 x 1024 Pixel Pentaxobjektiv: C30811, 8,5 mm, f/1.5 Fluoreszenzküvette: Starna F71-Q/10 Bilder: Hochschule Reutlingen

Mithilfe der Fluoreszenzspektroskopie lassen sich kleinste Veränderungen in der molekularen Umgebung auffinden. Der Beitrag zeigt am Beispiel eines 2D-Fluoreszenzspektrometers, wie Stoffgemische online unterschieden werden können.

Die Fluoreszenzspektroskopie ist eine empfindliche Methode, um kleinste Veränderungen in der molekularen Umgebung zu detektieren. Bei komplexen Gemischen nehmen viele Faktoren Einfluss auf das Emissionsspektrum [1]. Bei einer Fermentation ist es z.B. notwendig, sowohl den Wachstumsverlauf der Zellen und deren Metabolismus als auch die Substratkonzentration zu beobachten, um eine größtmögliche Ausbeute zu erhalten. Für diese Multianalytbestimmungen eignet sich die Online-2D-Fluoreszenzspektroskopie. Durch die Aufnahme der Emissionsspektren bei unterschiedlichen Anregungsfrequenzen ist eine Unterscheidung der verschiedenen Spezies möglich [2]. Die anschließende multivariate Datenanalyse mittels Multivariate Curve Resolution (MCR) oder Parallel Factor Analyse (PARAFAC) liefert Zugang zur Konzentration der einzelnen Analyte und zu deren Kinetik [3, 4].

Die bisher eingesetzten Online-Fluoreszenzspektrometer detektieren das Emissionsspektrum bei einer fest eingestellten Anregungswellenlänge, oder es werden mit einem Filterrad verschiedene Anregungswellenlängen nacheinander durchgefahren. In der Regel dauert die Aufnahme eines kompletten 2D-Spektrums mehrere Minuten bei einer spektralen Auflösung von ca. 20 nm. Das hier vorgestellte Spektrometer mit Pushbroom-Technik kann im Sekundentakt ein vollständiges 2D-Fluoreszenzspektrum mit einer spektralen Auflösung von 2 nm aufnehmen.

Aufbau und Technik

Als Pushbroom-Technik wird ein spektrales Imaging-Verfahren bezeichnet, das eine Zeile eines Bildes spektral aufgelöst abbildet. Dieses Verfahren hat den Vorteil, eine Bildzeile simultan orts- und spektralaufgelöst abzubilden.

Beim Versuchsaufbau ist das Grundelement ein Monochromator der Firma Spex. Eine externe Xenonlampe dient als Anregungslichtquelle, die mittels Spiegel in den Monochromator eingekoppelt wird. Ein Gitter spaltet das Licht spektral in horizontaler Ebene auf. Ein Teil des spektralen Bereichs wird in einem Spiegelsystem eingekoppelt und auf einer Durchfluss-Fluoreszenzküvette abgebildet. In dem Strahlengang ist ein Filterwechsler eingebaut, um das Licht der 2. Ordung herauszufiltern. Senkrecht zum Anregungslicht wird die Emission der einzelnen Anregungswellenlängen mit einer Optik auf den Eingangschlitz des Pushbroom-Imagers abgebildet. Je kleiner man diesen Eingangschlitz wählt, desto höher ist die spektrale Auflösung des Systems, jedoch bei geringer Intensität. Der Pushbroom-Imager trennt über eine Prisma-Gitter-Prisma-Optik das Emissionslicht z.B. von 380 nm bis 750 nm auf. Die entstandenen Spektren werden dann ortsaufgelöst auf den CCD-Chip einer Schwarz-Weiß-Kamera abgebildet. Die x-Achse der CCD entspricht den unterschiedlichen Anregungswellenlängen und die y-Achse den Emissionspektren. Die Empfindlichkeit und damit die Schnelligkeit, 2D-Spektren aufzunehmen, ist von der Empfindlichkeit der Kamera und dem Eingangsschlitz des Pushbroom-Imagers abhängig.

Zur Kalibrierung des Systems werden ein Linienstrahler mittels Lichtwellenleiter in die Küvette eingekoppelt und die Pixel der CDD-Kamera mit den entsprechenden Wellenlängen der Spektrallinien zugeordnet. Anhand zweier Testsubstanzen wird die Anregungswellenlänge des Monochromators justiert. Dazu wird die Durchflussküvette gegen einen Fluoreszenzstandard von Starna ausgetauscht und über die Monochromatorsteuerung der gewünschte Anregungsbereich gewählt.

Kalibrierung und Auswertung

Zur Kalibrierung, Bildaufnahme und Auswertung wurde eine Software auf Basis von LabView entwickelt. Die Software besitzt neben der Onlinefähigkeit auch die Möglichkeit der Online-Auswertung mit einem multivariaten Modell. Der Verlauf der Hauptkomponenten mit der Zeit kann damit online dargestellt werden.

Die MCR oder die PARAFAC sind gängige Verfahren, um aus den vielen Daten die Einzelkomponenten und deren Konzentrationsänderung zu isolieren. Das Ergebnis der Analyse zeigt die Anregungsspektren (x-Loadings), die Emissionsspektren (y-Loadings) und den Konzentrationsverlauf (Score-Plot) für jede einzelne Komponente. Am Beispiel der pH-Abhängigkeit des Fluorescein können so die Einzelkomponenten mathematisch bestimmt werden, ohne dass diese getrennt vorliegen müssen. Das Modell wurde im Beispiel mit zwei Komponenten gerechnet. Das System soll nun im nächsten Schritt in eine Sonde integriert werden, damit auch In-line-2D-Fluoreszenzmessungen möglich sind.

Hintergrund: Biologische Prozesse online verfolgen

Mit der Online-2D-Fluoreszenzspektroskopie können biologische Prozesse, z.B. Hefe-Kultivierung, Bierbrauprozesse oder Fermentationen, verfolgt werden [5]. Dazu werden die intrinsischen fluoreszierenden Bestandteile wie NADH, Tryptophan, Flavine, FAD, Pyridoxin oder andere Chromophore erfasst. Über die multivariate Datenanalyse können anschließend Zusammenhänge zwischen der Fluoreszenz und den Zielgrößen wie die Biomassekonzentration oder der Produktkonzentration hergestellt und online Vorhersagen über den weiteren Verlauf des Prozesses prognostiziert werden. Oftmals ist es jedoch nicht möglich die gefundenen Faktoren mit Spektren der Einzelchromophore zu identifizieren, da nur nach rein mathematischen Gesichtspunkten das Modell erstellt wird. Dennoch erlauben die Hauptkomponenten häufig eine Aussage über den Verlauf der Reaktion und können somit zur besseren Prozessüberwachung eingesetzt werden.

[1] Scheper, T., Hitzmann, B., Stärke, E., Ulber, R., Faurie, R., Sosnitza, P., Reardon, K., Bioanalytics: detailed insight into bioprocesses, Anal. Chim. Acta 400, 121-143, 1999

[2] R.W. Kessler, (ed), Prozessanalytik – Strategien und Fallbeispiele aus der industriellen Praxis, Wiley-VCH, 2006

[3] Kessler W., Kessler R.W., Multivariate curve resolution: a method of evaluating the kinetics of biotechnological reactions, Anal. Bioanal. Chem., 384, 1087-1095, 2006

[4] Bro, R., Kiers, H.A.L., A new efficient method for determining the number of components in PARAFAC models, J. Chemom. 17 (5), 274–286, 2003

[5] Boehl D., Entwicklung einer Online-Analytik zur Bioprozessbeobachtung auf Basis der 2D-Fluoreszenzspektroskopie, Dissertation, Universität Hannover, 2003

T. Merz ist wissenschaftlicher Mitarbeiter und R. Kessler Leiter der Abteilung Prozessanalytik am Institut für Angewandte Forschung, Reutlingen.

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